lncRNA DLX6-AS1靶向miR-195-5p調控前列腺癌細胞增殖、侵襲

劉俊玲 肖艷景 婁欣 白慧麗 張全武

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院病理科，河南 鄭州 450000)

非編碼RNA在各種人類疾病中的關鍵作用，其可分為短鏈非編碼RNA(<200個核苷酸)和長鏈非編碼RNA(lncRNAs；>200 核苷酸)〔1〕。 lncRNA參與各種生理和病理過程，包括增殖、分化、侵襲或染色體失活〔2，3〕。lncRNA DLX6-AS1在正常的腦組織中過度表達，在肺腺癌中觀察到高DLX6-AS1表達并且與組織學分化和TNM分期相關〔4，5〕。 DLX6-AS1在肝細胞癌組織中也有上調，并與臨床預后相關〔6，7〕。 然而，DLX6-AS1如何調節前列腺癌發生及其與前列腺癌發展相關的分子機制仍然未知。本研究旨在探討lncRNA DLX6-AS1靶向miR-195-5p調控前列腺癌細胞增殖侵襲。

1 材料與方法

1.1材料 前列腺癌細胞PC3、正常前列腺上皮細胞RWPE-1購自美國ATCC；DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、四甲基偶氮唑藍(MTT)、胰蛋白酶均購自美國Sellect公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉錄試劑盒購自大連Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司；十二烷基硫酸鈉-基丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、電化學(ECL)發光液和放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液均購自碧云天生物技術公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司；基質膠、Transwell小室購自美國BD。

1.2方法

1.2.1細胞的培養 將前列腺癌細胞PC3、正常前列腺上皮細胞RWPE-1用含10% FBS的DMEM培養基，置于37℃，5%CO2的恒溫培養箱中常規培養，待細胞生長至融合度75%左右，用胰蛋白酶消化約1 min，按照1∶3的比例更換培養基，每2 d傳代1次。

1.2.2細胞的轉染 調整PC3細胞至105個/ml，將si-NC、si-DLX6-AS1、miR-NC、miR-195-5p、si-DLX6-AS1+anti-miR-NC、si-DLX6-AS1+anti-miR-195-5p按照脂質體LipofectamineTM2000試劑盒說明書要求將以上核酸序列按照1∶2的比例添加至PC3細胞，轉染48 h，用qRT-聚合酶鏈反應(PCR)檢測轉染效率，轉染成功后分別標記為si-NC組、si-DLX6-AS1組、miR-NC組、miR-195-5p組、si-DLX6-AS1+anti-miR-NC組、si-DLX6-AS1+anti-miR-195-5p組，用于后續試驗。

1.2.3qRT-PCR檢測細胞中DLX6-AS1、miR-195-5p的表達 按RNA抽提試劑盒說明書要求提取RNA，進行定量，然后按逆轉錄試劑盒按照說明書操作合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說明書操作進行DLX6-AS1、miR-195-5p的檢測。以U6 為內參，用2-△△Ct計算DLX6-AS1、miR-195-5p的表達。U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；DLX6-AS1：上游引物5′-AGTTTCTCTCTAGATTGCCTT-3′，下游引物5′-ATTGACATGTTAGTGCCCTT-3′；GAPDH上游引物5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′；miR-195-5p上游引物5′-GCGTAGCAGCACAGAAATATTGGC-3′，下游引物5′-CTGTCGTCGTAGAGCCAGGGAA-3′。

1.2.4MTT比色法檢測細胞的增殖 將1.2.2各組細胞制成混懸液，調整密度至104個/ml，然后接種至96孔板，取適量1.2.2各組細胞，每孔加MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃孵育4 h，終止培養，棄去培養液上清，然后每孔加150 μl DMSO，振蕩使結晶充分融解，在490 nm波長下檢測細胞吸光度(A)。細胞的增殖能力與細胞的吸光度呈正比。

1.2.5Transwell法檢測細胞的遷移和侵襲 調整細胞密度至106/孔接種細胞6孔板，培養至融合度達到75%，更換為對應的無血清培養基培養過夜。取100 μl加入上室內，600 μl含血清的培養基加入下室內，細胞常規培養過夜。取出小室，用棉簽擦去上室內的細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，PBS洗滌2次。顯微鏡下(400倍)觀察小室下表面附著的遷移細胞，隨機取3個視野拍照計數，取平均數。將Transwell小室上表面鋪適量厚度的基質膠，然后按照上述操作方法操作。最后顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細胞。

1.2.6雙熒光素酶報告基因檢測 按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書操作。psiCHECK2載體以螢火蟲熒光素酶活性為內參，psiCHECK2-DLX6-AS1 WT和psiCHECK2-DLX6-AS1 MUT的表達為對照，轉染24 h后，檢測熒光強度。海參熒光素酶的發光強度與螢火蟲熒光素酶發光強度的比值即反應DLX6-AS1與miR-195-5p的結合力。

1.3統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1DLX6-AS1和miR-195-5p在前列腺癌細胞PC3和前列腺上皮細胞RWPE-1中的表達 與RWPE-1組相比，PC3組細胞中 DLX6-AS1表達顯著升高，miR-195-5p表達顯著降低(P<0.001)。見表1。

表1 DLX6-AS1和miR-195-5p在前列腺癌PC3細胞和前列腺上皮細胞RWPE-1中的表達

2.2抑制DLX6-AS1表達對前列腺癌PC3細胞增殖的影響 與si-NC組相比，si-DLX6-AS1組細胞中DLX6-AS1表達量顯著降低，48、72 h時，細胞活性顯著降低(均P<0.01，P<0.001)。見表2。

2.3抑制DLX6-AS1表達對前列腺癌PC3細胞遷移、侵襲的影響 與si-NC組相比，si-DLX6-AS1組PC3細胞的遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著降低(P<0.001)。見表2，圖1。

圖1 前列腺癌PC3細胞的遷移、侵襲(結晶紫染色，×400)

2.4miR-195-5p過表達對前列腺癌PC3細胞增殖、遷移、侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-195-5p組細胞中miR-195-5p表達顯著升高(P<0.05)，48、72 h時，細胞活性顯著降低(P<0.05)，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著降低(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 miR-195-5p過表達對前列腺癌PC3細胞遷移侵襲的影響(結晶紫染色，×400)

2.5DLX6-AS1靶向調控miR-195-5p 生物信息學預測結果見圖3，DLX6-AS1的3′UTR端具有7個與miR-195-5p的5′UTR端互補的核苷酸序列，UGCUGCU。與miR-NC組相比，miR-195-5p組WT-DLX6-AS1細胞的熒光活性顯著降低(P<0.05)，MUT-DLX6-AS1細胞的熒光活性變化不顯著(P>0.05)。見表4。與si-NC組細胞中miR-195-5p表達水平(0.33±0.03)相比，si-DLX6-AS1組(1.02±0.08)顯著升高，與pcDNA組(0.35±0.04)相比，pcDNA-DLX6-AS1組(0.12±0.03)顯著降低(P<0.05)。

圖3 DLX6-AS1的序列中含有與miR-195-5p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.6抑制miR-195-5p表達逆轉了抑制DLX6-AS1表達對PC3細胞增殖、遷移侵襲的作用 與si-DLX6-AS1+anti-miR-NC組相比，si-DLX6-AS1+anti-miR-496組細胞中miR-195-5p表達顯著降低，48、72 h時，細胞活性顯著升高，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著升高(均P<0.001)。見表5、圖4。

1～2：si-DLX6-AS1+anti-miR-NC組、si-DLX6-AS1+anti-miR-195-5p組圖4 抑制miR-195-5p表達逆轉了抑制DLX6-AS1表達對前列腺癌PC3細胞遷移侵襲的作用(結晶紫染色，×400)

3 討 論

大量研究發現lncRNAs作為競爭性內源RNA起作用以調節miRNA的表達水平，因此在癌癥的發展中起關鍵作用。An等〔8〕在胰腺癌的研究中發現，DLX6-AS1的高表達與較大的腫瘤大小、晚期TNM分期和淋巴結轉移呈正相關，敲除DLX6-AS1明顯抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲，另外，miR-181b是DLX6-AS1的下游靶標，敲除miR-181b可逆轉DLX6-AS1敲低引起的細胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用，此外，DLX6-AS1敲低還可抑制體內腫瘤生長和腫瘤轉移，揭示了DLX6-AS1通過減弱miR-181b在胰腺癌中的內源功能來促進癌細胞增殖和侵襲。Zeng等〔9〕研究發現，在腎細胞癌腫瘤組織中鑒定出與正常腎組織相比上調的lncRNA DLX6-AS1，DLX6-AS1通過靶向miR-26a促進腎細胞癌細胞生長和腫瘤發生，Li等〔10〕在肝癌的研究中，首次證明DLX6-AS1在癌組織和細胞系中與正常鄰近和細胞系相比明顯上調，本研究結果表明，通過靶向miR-424-5p，上調的DLX6-AS1促進肝癌的細胞增殖、遷移和侵襲。

miRNA與腫瘤生長、轉移、血管發生和藥物抗性有關。Tao等〔11〕研究發現，在前列腺癌患者中高水平的miR-195和miR-16與無復發生存率呈正相關，且miR-195和miR-16與PD-L1、PD-1呈負相關。Ma等〔12〕研究發現，異常的miR-195表達與前列腺癌的預后不良及存活率低相關，miR-195的較低表達出現在多西紫杉醇(DOC)抗性前列腺癌細胞中(DU145/DOC)，而非DOC敏感的前列腺癌細胞。miR-195提高了抗性前列腺癌細胞的敏感性DOC抑制CLU，提示miR-195可能是一種潛在的有希望的抗藥性分子靶標前列腺癌。