SNP分子標記及其在水稻研究中的應用

李筠

摘 要：SNP作為第3代分子標記，具有高密度、高遺傳性、高穩定性、高通量、二態性等特點，是目前被廣泛研究和應用的分子標記。本文介紹了SNP在不同研究工作中可采用的不同檢測平臺，同時探討了SNP在水稻功能標記、圖位克隆、等位基因、物種進化等方面的發現和應用，以期為讀者今后的研究提供參考。

關鍵詞：SNP；水稻；功能標記；等位基因

中圖分類號：S33 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160431013

單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP），是指在基因組上單個核苷酸的變異，包括置換、顛換、缺失和插入。目前SNP技術主要分為2大類，一類是以凝膠電泳檢測為基礎的，一類是以高通量檢測為基礎的。針對不同的研究工作，選用與之相適應的檢測平臺，將推進研究工作的快速進展。SNP已經成為水稻研究領域的一個重要工具，利用基因組中高密度分布的SNP分子標記，可以進行功能標記的開發、遺傳圖譜的構建、分子標記輔助育種、圖位克隆和功能基因組學、等位基因、物種進化等方面的研究工作。

1 SNP分子標記的特點

SNP是Lander E 于 1996年首次提出的一種分子標記[1]，作為第3代分子標記，它具備以下幾個特點：二等位多態性，即發生C-T，G-A的轉換，或者C-A，G-T，C-G，A-T的顛換，前者發生概率為2/3；高通量、自動化的實驗流程，包括芯片、測序等技術的應用；遺傳穩定性高，SNP標記的突變率低，且能夠在生物體基因組中穩定遺傳，其遺傳的穩定性高于SSR標記；在染色體上的覆蓋率高，在人類基因組中，每300～1000個堿基中即存在1個SNP；在水稻基因組中，每154個堿基即存在1個SNP[2]；SNP位點在基因內區域分布較多，有的位點可能與功能基因有關，可開發SNP功能標記。傳統的分子標記本身和基因功能沒有關系，而SNP功能標記和目標性狀是完全連鎖的，一旦遺傳效應與功能序列基序相對應，此基序衍生的功能標記就可以在不需要其它測定的情況下在多個遺傳背景中固定等位基因[3]。

2 SNP技術的介紹

近年來，隨著分子生物技術的發展，SNP技術也迅猛發展。從檢測的通量上可分為，以凝膠電泳為基礎的檢測方法和高通量、自動化程度較高的檢測方法2大類，前者包括單鏈構象多態性（SSCP）、變性梯度凝膠電泳（DDGE）、酶切擴增多態性序列（CAPS）、等位基因特異性PCR（AS-PCR）等，后者包括DNA測序、DNA芯片、變性高效液相色譜（DHPLC）、飛行質譜儀檢測、高分辨率溶解曲線（HRM）、TagMan實時熒光法等[4]。高通量、自動化程度較高的方法也是目前比較常用的，其中DNA測序和HRM也逐漸被芯片技術和基于PCR基礎上的技術所替代，各科研工作者可根據實際應用的不同需求選擇相應的檢測平臺。

例如，在分子育種工作中或者SNP位點開發中，需要的是位點高通量的檢測方法，那么芯片檢測法則是最好的選擇。芯片檢測法的一個代表為Affymetrix公司的GeneTitan Multi-Channel平臺，可適用于位點高通量的檢測，該芯片是激光微刻芯片，理論上100%將所有侯選SNP 位點都設計到芯片上，結果準確可靠；所有操作均在Biomek FXp實現，管理操作很簡單，且一周可以掃描768arrays或者3072arrays；另一個代表為Illumina公司的Infinium平臺和GoladenGate平臺，該芯片是光纖維珠芯片，Infimium芯片可用于位點更高通量的檢測，而GoladenGate芯片的通量適合于位點數小于3072的研究；在品種真實性鑒定工作中，需要的是樣品高通量的檢測方法，那么英國LGC公司的KASP平臺、美國Douglas的Array Tape平臺甚至是基于PCR技術上的TagMan實時熒光法則比較適合。

3 SNP在水稻研究中的應用概述

3.1 水稻SNP功能標記的開發和應用

很多分子標記本身和基因功能沒有關系，在雜交過程中標記會和目標性狀發生分離，特別是和目標性狀遺傳距離較大的標記，而SNP功能標記能很好地解決這方面的問題。水稻的基因組全序列測定已經完成，有豐富的功能基因組及生物信息學方面的資源可以利用，使相關功能標記的開發更容易進行。隨著一些重要農藝性狀基因被克隆，很多水稻SNP功能標記也被開發，例如Pi-ta基因、Wx基因、Rc基因、Xa-5基因、fgr基因、GS3基因、S5基因、S-a基因、Hd3a等。這些基因由于SNP的改變，引起了氨基酸的變化，進而引起基因功能的變化，那么就能利用引起變異的SNP位點設計功能標記。這樣，可以對材料進行快速篩查，分析具有目標基因的材料，對分子設計育種奠定了基礎。

3.2 SNP在圖位克隆和功能基因組學中的應用

利用SNP構建水稻精密遺傳圖譜，對目標基因進行精細定位，使目的基因定位在更窄的候選區間，甚至有些SNPs位點就在目的基因的編碼區內，為基因克隆、功能互補試驗帶來許多方便。另外，在功能基因組學方面，1個SNP的改變也可能引起基因功能的改變。例如，與水稻產量性狀相關的基因，GS3基因第2外顯子中1個堿基C突變為A，使胱氨酸（TGC）突變為終止密碼子（TGA，）使得水稻從在表型上從短粒變為長粒[5]。控制直粒穗形基因IPA1，由于第3外顯子的C突變為A，擾亂了OsmiR156 對IPA1的調控，IPA1突變后，使得水稻分蘗減少、穗粒數和千粒重增加，同時莖稈變得粗壯，抗倒伏能力增強，進而提高產量[5]。

3.3 SNP在水稻進化中的應用

水稻的馴化是一個漫長的過程，在其進化過程中，SNP的改變也可能引起秈稻和粳稻的區分。例如，控制水稻秈粳雜種育性的廣親和基因S5n，在編碼區273處，亮氨酸突變為苯丙氨酸，即A突變為C，導致粳稻突變為秈稻。控制水稻抽穗期的基因Hd17，研究者利用73個亞洲栽培稻（秈稻和粳稻）和37個野生稻測序，發現在第4外顯子的一個SNP的變化，從T突變為C，使得氨基酸從L變為S，引起基因功能的變化，導致粳稻突變為秈稻。

3.4 SNP在水稻等位基因中的應用

已克隆基因在不同的水稻材料中存在著不同的等位基因，其表型也會有差異，即表型的效應也不一樣。以水稻Wx基因為例，由于第1內含子T/G差異，第2外顯子的一處缺失，第6外顯子A/C差異，第9外顯子T/C差異，第10外顯子C/T差異，這5處SNP或者INDEL的差異，實驗證明都引起了基因功能的變化，使得水稻材料的表型也分為5類[7]。這些等位基因的區分，有助于基因的功能分析和新等位基因的發現，也為水稻設計育種奠定了良好的基礎。

4 結語

隨著分子生物技術的不斷發展，SNP技術也是日新月異，從以凝膠電泳檢測為基礎發展到現在的高通量自動化的技術，然而，SNP分子標記的開發和應用成本仍然比較高，隨著SNP技術的進一步成熟，期望它的成本將能夠大大降低，甚至比SSR標記的成本還低；在水稻育種研究工作中，SNP與目標基因存在一定的關聯性，1個SNP的改變可能引起基因功能的改變，引起某些性狀表型的變異，因此SNP發揮著其它分子標記無法比擬的重要作用。隨著功能基因組學的不斷進步，期望能更加快速發現水稻所有的SNP功能標記，加速育種技術的革新，創立新型的育種理論和體系。

參考文獻

[1]Lander E.S. The new genomics： global views of biology[J].Science，1996：539.

[2]劉傳光，張桂權.水稻單核苷酸多態性及其應用[J].遺傳，2006，28（6）：737- 744.

[3]Andersen J.R.，Lubberstedt T. Functional markers in plants[J]. Trends Plant Sci，2003（8）：554-560.

[4]許家磊，王宇，后猛，等.SNP檢測方法的研究進展[J]. 分子植物育種，2015，13（2）：475-482.

[5]Fan C.H.，Yu S.B.，Wang C.R.，et al.A causal C-A mutation in the second exon of GS3 highly associated with rice grain length and validated as a functional marker[J].Theor Appl Genet，2008，118（3）：465-472.

[6]Jiao Y. Q.，Wang Y. H.，Xue D. W.，et al.Regulation of OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice[J].Nature Genetics，2010，42（6）：541-544.

[7]Teng B.，Wang Y. C.，Zeng R Z.，etal.Detection of allelic variation at the Wx locus with single-segment substitution lines in rice（Oryza sativa L.）[J].Mol Breeding， 2012（30）：583-595.