β—甘露聚糖酶基因的克隆及原核表達載體的構(gòu)建

張云暉　關(guān)珍貞　王霞

摘要：目的：克隆β-甘露聚糖酶基因并構(gòu)建其原核表達載體。方法：提取地衣芽孢桿菌ATCC 14580基因組，PCR法擴增該菌基因組中的β-甘露聚糖酶基因，與表達載體pET-28a連接并轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，構(gòu)建原核表達載體，并對陽性重組菌進行PCR和酶切鑒定。結(jié)果：成功克隆β-甘露聚糖酶基因并構(gòu)建其原核表達載體，β-甘露聚糖酶基因全長1008bp，編碼336個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量約為38KDa。SDS-PAGE檢測顯示重組酶分子量約為38KDa。結(jié)論：成功構(gòu)建β-甘露聚糖酶基因的原核表達載體為基因的重組表達奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：地衣芽孢桿菌；β-甘露聚糖酶基因；克隆；原核表達載體

項目基金：吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院校級微生物重點學(xué)科培育項目（編號：吉農(nóng)院合字〔2013〕第X006 號）；大學(xué)生科技創(chuàng)新科研項目（編號：吉農(nóng)院合字〔2009〕第112號）

中圖分類號： Q943.2 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.11.023

β-甘露聚糖酶（β-mannanase，EC.3.2.1.78）是一類半纖維素水解酶，能夠催化甘露多糖（如半乳甘露聚糖、甘露聚糖等）的β-1，4甘露糖苷鍵隨機水解，生成一系列低分子量的寡糖[1]。作為一種新型的酶制劑，β-甘露聚糖酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料、紡織、印染、洗滌、農(nóng)業(yè)、造紙、石油開采及環(huán)境治理等諸多領(lǐng)域[2]。

對β-甘露聚糖酶的早期研究主要集中在產(chǎn)酶菌株的選育、提純、發(fā)酵條件優(yōu)化等方面，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，自20世紀90年代起，人們開始在分子水平上研究β-甘露聚糖酶，并迅速取得了豐碩的成果，目前已有多種微生物來源的β-甘露聚糖酶基因被分離、克隆，甚至實現(xiàn)異源表達[3，4]，但是關(guān)于地衣芽孢桿菌ATCC 14580 β-甘露聚糖酶基因的克隆及異源表達則尚無報導(dǎo)。本研究克隆了產(chǎn)地衣芽孢桿菌ATCC 14580 β-甘露聚糖酶基因，并構(gòu)建其原核表達載體，為研究β-甘露聚糖酶的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)，開辟β-甘露聚糖酶工業(yè)化生產(chǎn)的新途徑，提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與載體 地衣芽孢桿菌ATCC14580購自上海北諾生物科技有限公司，E.coli BL21為實驗室保存，pMD18-T質(zhì)粒購自寶生物工程（大連）有限公司，pET-28a質(zhì)粒購自上海佳和生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 Bam HⅠ、HindⅢ、T4 DNA 連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA marker，均購自寶生物工程（大連）有限公司，IPTG購自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純，培養(yǎng)基為常規(guī)LB培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1 β-甘露聚糖酶基因的克隆 參照精編分子生物學(xué)實驗指南的方法提取地衣芽孢桿菌ATCC 14580的基因組[5]。根據(jù)已報道的地衣芽孢桿菌ATCC 14580全基因組序列以及其它芽孢桿菌的β-甘露聚糖酶基因序列，利用LaserGene軟件尋找地衣芽孢桿菌ATCCC14580的β-甘露聚糖酶基因序列，并設(shè)計引物，引物中分別加入Bam HⅠ和HindⅢ（下劃線部分）的酶切位點，引物序列分別：5'-GGATCCACACCGTT

TCTCCGGTG -AAC-3'，5'-AAGCTTCCACGA CAGGCGT。

以地衣芽孢桿菌ATCC14580基因組為模板，擴增β-甘露聚糖酶基因。PCR反應(yīng)體系為：94℃預(yù)熱5分鐘；94℃，45 秒，50℃，45秒，72℃，1分鐘，30個循環(huán)；最后，72℃延伸10分鐘。回收PCR產(chǎn)物并與pMD18-T載體連接，重組DNA轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中，進行藍白斑篩選，提取白色菌落質(zhì)粒，送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，同時進行PCR驗證[6]。

1.2.2 β-man基因原核表達載體的構(gòu)建 用BamHⅠ、HindⅢ分別雙酶切pET-28a質(zhì)粒和經(jīng)驗證正確的克隆基因，回收酶切后的大片段，用T4 DNA liganase連接，重組DNA命名為pET-28a-man，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中初篩陽性重組菌，提取質(zhì)粒進行PCR和酶切鑒定。

2 結(jié)果分析

2.1 β-man基因的克隆

PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示，擴增產(chǎn)物約為1008bp的基因片段，條帶單一，特異性強，與預(yù)期1008bp大小一致。

2.2重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-man鑒定

測序結(jié)果表明該基因全長1008bp，DNA MAN 軟件分析出該基因編碼336個氨基酸，分子量約為38KDa。以初篩陽性重組菌質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增并電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，PCR產(chǎn)物為大約1008bp的DNA片段，與預(yù)期大小一致，表明pMD18-T-man構(gòu)建成功。

2.3 原核表達載體pET-28a-man鑒定

提取抗性初篩存活的E.coli BL21質(zhì)粒，并以其為模板進行PCR鑒定，結(jié)果如圖3所示，獲得了大小約1008bp DNA片段，說明構(gòu)建的重組載體中含有β-man基因。BamHⅠ和HindⅢ雙酶切重組質(zhì)粒并電泳檢測，分別獲得了一大一小兩個DNA片段，大片段為5343bp的pET28a部分片段，小片段為克隆的β-man基因，說明原核表達載體pET-28a-man構(gòu)建成功。

3 討論

β-甘露聚糖酶在自然界中廣泛存在，目前在動物、植物和微生物中都有發(fā)現(xiàn)，其中微生物是該酶的主要來源，也是工業(yè)化生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的主要來源[7]。研究發(fā)現(xiàn)，β-甘露聚糖酶在原始菌株中一般分泌量比較低，提純困難，因此，利用基因工程技術(shù)克隆β-甘露聚糖酶基因，并使之在大腸桿菌、酵母等細胞中高效穩(wěn)定表達是該酶生產(chǎn)的有效途徑[8]。本研究首次將地衣芽孢桿菌ATCC14580的β-甘露聚糖酶基因與原核表達載體pET-28a連接，并轉(zhuǎn)入E.coli BL21中，成功構(gòu)建了該基因的原核表達載體。后續(xù)將研究該基因在重組菌中的原核表達和酶學(xué)性質(zhì)，并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期獲得高產(chǎn)量、高品質(zhì)β-甘露聚糖酶。

參考文獻

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[6]何冬蘭，張瑩，彭寶玉.重組谷氨酞胺轉(zhuǎn)胺酶基因的原核表達研究[J]. 中南民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，29（4）：32-36.

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[8]龔月生，劉錦妮，王晶.耐熱盡半乳糖普酶基因在大腸桿菌中的表達及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，36（10）：59-65.

作者簡介：張云暉，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，在讀本科生，研究方向：分子生物學(xué)。

通訊作者：王霞，碩士，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，講師，研究方向：

分子生物學(xué)。