一種從羊奶中檢測牛奶和大豆成分多重實時熒光定量PCR方法的建立

范陽陽 張犖嘉 劉艷艷 卞如如 霍勝楠 張卉 張全芳 步迅

摘要：羊奶制品因其良好的營養功效備受消費者的青睞，也是乳制品主要摻假對象。本研究參考市場可能摻假現狀，分別根據羊和牛線粒體基因組16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因（GI：510514）序列，設計一對牛和羊特異性引物、一對大豆特異性引物以及相應的TaqMan-MGB 探針，建立羊奶中牛奶和大豆成分多重實時熒光定量PCR檢測方法，并引入內標質控有效保證檢測體系的準確性。本檢測體系對羊奶、牛奶及豆漿的基因組DNA檢測敏感度為0.01 ng；對羊奶中摻入牛奶和豆漿的體積摻假檢測靈敏度均為0.1%。因此，本研究建立的羊奶中牛奶和大豆成分多重實時熒光定量PCR檢測體系具有通量大、靈敏度高、特異性好等優點，實現了對羊奶中其他源性成分快速、準確的檢測，對保障相關產品市場安全具有重要意義。

關鍵詞：羊奶；牛奶；豆漿；多重實時熒光定量PCR

中圖分類號：S879.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）06-0118-06

由于羊奶中含有的維生素和微量元素均高于牛奶，并且含有大量的乳清蛋白，其所含有的蛋白結構成分與母乳基本相同，被營養學界稱之為“奶中之王”[1]。羊奶中不含引起人體過敏的異性蛋白，尤其適合胃腸較弱、體質較差的嬰幼兒飲用，但市場上的羊奶品質參差不齊。隨著消費者認可度的不斷提高，在利益的驅動下，在羊奶中摻入牛奶或者豆漿的現象非常普遍，摻假手段多種多樣，不斷變換，僅靠感官鑒評和傳統的試驗方法已不能滿足市場需要[2]，嚴重影響我國奶業的健康發展。

目前，用于檢測羊奶摻假的方法主要有氣象色譜、液相色譜、電泳、PCR、ELISA和近紅外光譜法等[3～6]。實時熒光定量PCR方法是以DNA為基礎的一種檢測技術，不受摻假形式的影響，可以進行快速、批量、自動、實時檢測分析，具有靈敏度高、準確性好等優點，已經在動物源性成分檢測項目上逐步取代一般PCR方法成為最常用的分子生物學檢測手段[7]。為了保障羊乳及其產品品質，確保消費者的利益，建立準確檢測牛羊乳及豆漿混摻的技術越來越重要。本試驗旨在利用TaqMan探針實時熒光定量PCR方法，建立一種快速、準確檢測羊奶中是否摻有牛奶和豆漿的方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1試驗材料試驗所用標準液態牛奶、液態羊奶取自山東省畜牧研究所奶牛及山羊養殖基地，液態豆漿是本實驗室用大豆加工而成。市售樣品為購自濟南市大、中、小型超市的不同品牌奶制品。

1.1.2主要試劑與儀器試劑：Chelex-100（天根生化科技有限公司，北京）、蛋白酶K（TaKaRa，日本）、核算定量檢測試劑盒（TaKaRa，日本）。

儀器：ABI7500實時熒光定量PCR儀（ABI，美國）、高速冷凍離心機（Eppendorf，德國）、Nanodrop 核酸蛋白含量測定儀（Eppendorf，德國）。

1.2試驗方法

1.2.1樣品基因組DNA的提取分別取牛奶、羊奶、豆漿液體樣品2 mL加入2 mL無菌離心管中，2 500 r/min、4℃恒溫離心30 min，棄上清液保留沉淀；向離心管中加入1 mL無菌磷酸鉀緩沖液（pH 7.4），輕輕混勻后轉移至1.5 mL離心管中，3 500 r/min室溫離心10 min，棄上清；向沉淀中分別加入280 μL 5%Chelex-100和20 μL 20 mg/mL蛋白酶K，56℃孵育30 min，漩渦震蕩10 s混合均勻，100℃煮沸8 min，13 000 r/min離心3 min；將上清加入吸附柱中13 000 r/min離心1 min收集液體；向收集液中加入20 μL GlassMilk 和600 μL gDNA Binding Buffer充分混勻，65℃水浴15 min（其間不斷輕柔地上下翻轉離心管），室溫放置5 min（其間不斷輕柔上下翻轉離心管）；4 000 r/min離心1 min，棄上清；向離心管中加入500 μL 70%乙醇，8 000 r/min離心1 min，棄上清，重復2次；加入500 μL無水乙醇輕輕混勻，8 000 r/min離心1 min，棄上清；8 000 r/min離心30 s，用10 μL槍頭吸走殘余液體，室溫放置至徹底干燥；加入100 μL TE（pH 7.0）70℃水浴5 min，瞬間離心，轉移上清液至新的離心管中-20℃保存備用。使用Nanodrop 核酸蛋白含量測定儀測定核酸濃度。

1.2.2引物及探針設計分別參照牛、山羊和綿羊線粒體基因組中高度保守的16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因（GI：510514）序列，用Primer Premier 5.0設計牛奶、羊奶通用引物序列（UF、UR），大豆引物序列（Lectin-F、Lectin-R），內參引物序列（IACF、 IACR）。使用Beacon Designer 2.0 設計特異分子信標（MB）探針，其中牛奶探針（NP）用CY3標記，羊奶探針（YP）用JOE標記，豆漿探針（LectinP）用FAM標記，內標探針（IACP）用ROX標記，3′端的淬滅基團用Dabcyl修飾。引物及探針序列見表1。

1.2.3多重實時熒光定量PCR檢測體系建立通過優化反應體系中的引物濃度、探針濃度和退火溫度等條件，建立分別檢測羊、牛和大豆源性成分的單重熒光定量PCR體系。將4種引物及探針組合在一起，分別或同時以羊、牛和大豆基因組DNA為模板，優化引物、探針濃度和退火溫度等反應體系和條件，建立能同時檢測羊、牛和大豆源性成分的多重熒光定量PCR體系。

1.2.4結果判定實時熒光定量PCR擴增結束后獲取Ct值，當Ct值<35時，視為檢出動物源性成分；當Ct值≥35時，視為未檢出動物源性成分。

1.2.5基因組DNA檢測靈敏度試驗分別提取羊奶、牛奶及豆漿的基因組DNA，用Nanodrop定量到50 ng/μL，做10倍梯度稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4），對每個梯度按照優化后的擴增體系和條件分別進行檢測。

1.2.6羊奶中摻雜牛奶或豆漿靈敏度試驗將豆漿和羊奶以一定體積比例混合，制成豆漿含量分別為0、0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的混合奶樣品；將牛奶和羊奶以一定比例混合，制成牛奶含量分別為0、0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的混合奶樣品。按照優化后的反應體系和條件分別進行檢測。

1.2.7市售樣本檢測使用優化后的熒光定量PCR方法對35份奶制品樣本進行源性鑒定，驗證檢測方法的實用價值。

2結果與分析

2.1多重實時熒光定量PCR檢測體系的建立

參照優化的單重熒光定量PCR反應體系及條件，將羊、牛、大豆和內標質控的引物及探針組合在一起，先分別以羊、牛和大豆基因組DNA為模板優化反應體系，然后同時加入3種基因組DNA模板，通過調整反應體系中主要成分濃度和體積以及反應條件，優化反應體系，最終篩選出最適宜的多重實時熒光定量PCR體系。20 μL反應體系包括5× Premix 4 μL，HS-Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，引物 Mix（2 μmol/L）2 μL， 探針 Mix（2 μmol/L）2 μL，內標質控IAC DNA模板（1 ng/μL）2 μL，檢測樣品DNA 模板2 μL，雙蒸水7.8 μL。PCR反應條件為：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、34 s，40個循環，60℃延伸時收集熒光信號。圖1為多重實時熒光定量PCR擴增曲線圖，其中A圖同時檢測出羊和牛源性成分，大豆源性為陰性；B圖樣本中同時檢測出大豆和牛源性成分，羊源性成分為陰性。

2.2基因組DNA靈敏度試驗

結果（圖2）顯示，當模板DNA濃度稀釋至10-4倍，即DNA質量為0.01 ng時，所建立的熒光定量PCR檢測體系仍然能夠產生良好的特異擴增曲線。此時純羊奶、牛奶及豆漿模板檢測到的Ct值分別為33.64±0.02、34.80±0.018和34.87±0.03，均<35，因此確定本研究中多重實時熒光定量PCR體系模板DNA質量檢測下限為0.01 ng。

2.3羊奶中摻雜牛奶或豆漿靈敏度試驗

將牛奶或豆漿以0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的體積比摻入至純羊奶中，結果顯示當牛奶或豆漿含量為0.1%時，多重實時熒光定量PCR體系仍有特異性擴增曲線，并且其Ct值均<35（圖3A、B），且隨著牛奶或豆漿摻入比例增加，Ct值越來越小。說明本研究建立的多重實時熒光定量PCR檢測體系對牛奶和豆漿的體積摻假檢測限為0.1%。

2.4市售樣本的實際檢測

利用本研究建立的羊奶中牛奶和大豆源性多重熒光定量PCR檢測體系對35份市售羊奶、羊奶粉、牛奶、牛奶粉進行源性鑒定。結果如表2所示，15份羊奶及相關制品中都含有羊源性成分，其中10份含有牛源性成分，4份含有大豆成分，分別占樣本總數的66%和26%；20份牛奶及相關制品中全部檢出牛源性成分，9份樣品中檢測出大豆成分，占樣本總數的45%。

3討論與結論

目前現有的牛羊乳檢測方法多是依據羊乳和牛乳化學組成上的差異，以牛羊乳中蛋白質、脂肪、DNA、維生素等為特征指標進行檢測[8]。色譜-質譜結合技術是分離蛋白質、定量檢測牛羊乳混摻的重要方法，有研究表明該方法可以實現牛羊乳混摻的快速檢測，能檢測牛羊混合乳中牛乳含量的最低水平為5%[9]。毛細管電泳-質譜聯用（CE-MS）技術也在牛羊乳檢測中得到了應用[10]，但存在檢測靈敏度偏低的缺點[11]。利用近紅外光譜法檢測摻假羊奶需要足夠的專業知識，建立模型才能對檢測結果進行分析，對檢測人員的要求較高，不易普及推廣[12]。熒光定量PCR方法是基于DNA水平的檢測，克服了以上技術的不足，被越來越多地應用到奶制品的檢測中。由于核酸比蛋白質更穩定，抗熱能力更強，并且含有更多遺傳信息，所以基于DNA的動物源性檢測方法比蛋白免疫法更有優勢[13]。

曾少靈等用多重實時熒光定量PCR檢測牛、山羊和綿羊源性成分[14]；孟芳等應用熒光定量PCR方法僅能鑒別牛、羊奶[15]；劉小艷等用實時熒光定量PCR方法檢測模擬奶制品中常見谷物成分的檢出限為0.5%[16]。本研究參照牛、山羊和綿羊線粒體基因組中高保守的16S rRNA基因和大豆的KTi-S基因為靶基因設計探針建立多重實時熒光定量PCR檢測方法，該方法不僅能夠針對羊奶、牛奶和豆漿進行快速準確的鑒別，而且能對奶制品進行摻假檢測；在擴增循環內只出現特異性擴增曲線無交叉擴增曲線；對純DNA含量的最低檢出濃度為0.01 ng；對模擬摻假的奶制品中目標成分的最低檢出限為0.1%（V/V），說明本研究建立的多重實時熒光定量PCR方法具有特異性好、靈敏度高等優點。經實際市售奶制品檢測驗證了其可行性和適用性，適用于奶類樣品摻假的快速檢測。

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