表柔比星、奧沙利鉑和5—Fu對肝癌的凋亡影響

曹園園　李青山

摘要：目的 探討表柔比星（Epirubicin）及聯合5-氟尿嘧啶（5-FU）、奧沙利鉑（L-OHP）對人肝癌細胞株HepG2的凋亡的影響。方法 應用MTT法觀察上述藥物單藥應用、兩藥及三藥同時或序貫聯合應用對細胞HepG2生長的影響，評價藥物聯合應用的效果。結果 單藥應用、兩藥聯合及三藥聯合應用均對HepG2細胞有顯著的抑制作用（P<0.05）；兩藥聯合應用均優于各自單藥的抑制效果，5-FU聯合L-OHP弱于5-FU或L-OHP與表柔比星聯合的抑制效果（P<0.05），由L-OHP到5-FU小劑量序貫聯合具有明顯的協同作用；三藥聯合應用的抑制效果顯著優于兩藥聯合（P<0.05），由表柔比星+L-OHP到表柔比星+5-FU的序貫聯合應用與三藥同步聯合應用無顯著性差異（P>0.05），但由表柔比星+5-FU到表柔比星+L-OHP序貫應用時明顯低于三藥同步應用的效果（P<0.05），且三藥全量及半量聯合應用效果差異無顯著性（P>0.05）。結論 表柔比星+L-OHP序貫到+5-FU的聯合應用具有高效協同抑制人肝癌細胞株HepG2的作用。

關鍵詞：表柔比星；奧沙利鉑；氟尿嘧啶；細胞株HepG2

1 資料與方法

1.1細胞 細胞株HepG2 上海美軒生物。將細胞株置于10%胎牛血清RPMI1640（美國GIBCO）培養液（內含0.1%青霉素、鏈霉素），并于培養箱37℃、5%二氧化碳內培養。

1.2藥物 表柔比星：浙江海正藥業；5-氟尿嘧啶：上海旭東海普；奧沙利鉑：江蘇恒瑞。

1.3用MTT法檢測藥物對細胞的促凋亡作用 將對數生長期制成細胞懸液，濃度為2×105個/mL，并置于96孔板內培養，每孔200ul，加人藥物20ul。并分組：空白組、對照組和藥物實驗組，5-FU為9.375ug/ml、18.75ug/ml、37.5ug/ml、75ug/ml、150ug/ml、300ug/ml、600ug/ml；L-OHP為0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5

mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml、8.0mg/ml表柔比星為2.5ug/ml。根據SPSS17.0回歸分析IC30，藥物濃度為藥物的IC30，有研究證實以抑制率大于30%為最佳敏感界值。

1.4藥物聯合作用 篩選出5-FU的IC30為84.0ug/ml，L-OHP的IC30為86.4ug/ml。采用5-FU的終濃度為84.0ug/ml（全量）和42.0ug/ml（半量）L-OHP的終濃度為86.4ug/ml（全量）和43.2ug/ml（半量）。藥物實驗組又分為：①單藥組5-FU（全量84.0ug/ml和半量42.0ug/ml）、L-OHP（全量86.4ug/ml和半量43.2ug/ml）、表柔比星（2.5ug/ml）；②兩藥聯合組，包括兩藥同步化療（5-FU+LOHP、5-FU+表柔比星、L-OHP+表柔比星）和兩藥序貫化療（5-FU84.0ug/ml→L-OHP86.4ug/ml、5-FU42.0ug/ml→LOHP43.2ug/ml、L-OHP 86.4ug/ml→5-FU 84.0ug/ml、L-OHP43.2ug/ml→5-FU42.0ug/ml）；③三藥聯合組，包括三藥同步化療（5-FU 84.0ug/ml+L-OHP86.4ug/ml+表柔比星、5-FU42.0ug/ml+L-OHP43.2ug/ml+表柔比星）和三藥序貫化療（表柔比星+5-FU84.0ug/ml→表柔比星+L-OHP86.4ug/ml、表柔比星+L-OHP86.4ug/ml→表柔比星+5-FU84.0ug/ml、表柔比星+5-FU42.0ug/ml→表柔比星+L-OHP43.2ug/ml、表柔比星+ L-OHP43.2ug/ml→表柔比星+5-FU 42.0ug/ml）。每一個組都設計為四個復孔。單藥組直接加入各濃度藥物100ul；兩藥同步聯合時采用1：1方案，將藥物濃縮一倍，后各加50ul。這樣每一孔內的藥物濃度、體積和總量未發生改變；三藥同步聯合時，應用1：1：1方案，先將藥物濃縮2倍，再各加25ul，同樣為保證藥物濃度和總量不變，之后應補加25ul的培養基。序貫化療時，細胞株按著序貫方案中的順序先接受前一種藥物持續作用24h，之后小心棄除含藥培養液， 加入含后一種化療藥物的培養液，并持續作用24h，期間保持培養液總量不發生變化。置于培養箱（37℃、5% CO2）培養48h后，離心棄上清，加入200ul不含血清的培養液及20ul 5mg/mlMTT，繼續培養4h，之后再棄去培養液，加人200ul DMSO，并振蕩5min后用自動酶標讀數儀測OD值，進行藥物作用效應計算。

抑制率 =[（對照組吸光值（A）-實驗組吸光值（A））÷對照組吸光值（A）]×100%。

1.5兩藥聯合療效評價 采用fractional productconcept（fp值）[3]來評價兩藥相互作用的性質，fp值：I1+2/（I1+I2-I1*I2），其中I1+2：兩藥聯合作用平均抑制率，I1和I2：兩藥單獨作用平均抑制率； fp值>1，兩藥作用性質為協同；fp值=1，兩藥作用性質為相加；fp值<1，兩藥作用性質為拮抗。

1.6統計學方法 用SPSS17.0統計軟件處理，結果資料采用方差分析和t檢驗。

2 結果

2.1 5-FU、L-OHP對肝癌細胞HepG2的抑制作用 通過測定稀釋至不同梯度濃度的5-FU和L-OHP對細胞株HepG2生長的抑制作用，得出兩種藥物對HepG2的IC50值約為228.940ug/ml、2737.328ug/ml。

2.2表柔表星、5-FU及L-OHP不同方式的聯合用藥對肝癌細胞HepG2的抑制作用。

2.2.1單藥對肝癌細胞株HepG2的作用 表柔比星、5-FU及L-OHP單獨作用時，均能顯著的抑制肝癌細胞HepG2的生長（P<0.01）；且5-FU、L-OHP全量作用時抑制作用明顯優于半量藥物的作用（P<0.05）。見表1。

2.2.2兩種藥物以不同序貫聯合順序應用時對HepG2的生長抑制作用 各組藥物都可以有效抑制肝癌細胞HepG2（P<0.01），其中兩藥聯合優于單藥（P<0.01），且全量效果優于半量（P>0.05）；5-FU+表柔比星組對細胞株HepG2的抑制作用優于5-FU+L-OHP組（P<0.05）。兩藥同步時，5-FU+表柔比星表現了較好的協同作用，而L-OHP+表柔比星組則顯示出拮抗作用。5-FU與L-OHP同步化療時，各組均有顯著的抑制作用（P<0.01），但不同聯合組之間的抑制作用無統計學差異（P>0.05），5-FU聯合表柔比星的作用效果優于5-Fu聯合L-OHP（P<0.05）。關于不同劑量和順序的5-Fu及L-OHP的序貫化療，半量L-OHP→半量5-FU兩藥的序貫聯合具有協同作用，其余序貫聯合均表現為拮抗。見表2。

2.2.3 5-FU、L-OHP及表柔比星三藥聯合應用 三種藥物共同作用于肝癌細胞HepG2時，能明顯的降低其生存率（P<0.001），且較所有其他組合效果更優；三藥聯合時，不同劑量的藥物作用的細胞抑制率無統計學差異（P>0.05）；在三藥不同序貫聯合時，表柔比星+L-OHP→表柔比星+5-FU與同步聯合比較無顯著性差異（P>0.05），且均顯著高于表柔比星+5-FU→表柔比星+L-OHP序貫組（P<0.05）。見表3。

3 討論

肝癌的發病率在全世界范圍內不斷升高，運用多種治療手段綜合治療是肝癌目前的主要治療原則。化療在晚期肝癌治療中占據重要地位，但由于肝癌細胞對化療藥物不敏感及耐藥的問題，使得肝癌的化療效果不理想。目前，經研究證實較為有效的藥物有多柔比星類、5-FU類、鉑類。其中多柔比星在肝癌的治療中效果最優，有研究證實表柔比星與其效果相近，它們均屬于抗生素類抗腫瘤藥。奧沙利鉑屬新合成的3代鉑類藥物，與5-Fu有協同作用，以兩種藥物為主的FOLFOX4化療方案已于2011年被我國原發性肝癌診療規范推薦用于肝癌的姑息治療中。將以上三種藥物應用于本實驗中，通過觀察它們不同聯合及序貫應用時的最大抑制率，以篩選出最優的聯合方案，為臨床治療提供一定的實驗依據。

本實驗中我們探討了不同劑量的5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑分別與表柔比星組成的不同的聯合或序貫方案對細胞抑制率的影響，從中可以看到含表柔比星組的兩藥聯合方案的抑制作用顯著高于不含表柔比星組，表明與含表柔比星的聯合方案相比，5-氟尿嘧啶聯合奧沙利鉑并未顯示明顯的優勢。另外在三藥聯合應用時對細胞的抑制率達到最高，表明三藥聯合相對于單藥、兩藥而言為效果最優的化療方案。并且表柔比星同步奧沙利鉑到表柔比星同步氟尿嘧啶時的序貫聯合與三藥同步聯合時比較差異無統計學意義，表明此種序貫不僅沒有降低療效，而且同樣可以達到三藥同步時的藥效，為臨床尋找最優的序貫方案提供一定的實驗依據。另外當存在藥物劑量（全量、半量）不同時，其結果比較差異亦無統計學意義，表明全量應用與半量應用的療效相當，所以在保證療效不變的前提下，可以降低劑量，從而降低藥物的毒副作用，使其能更好的應用于臨床。

由上述得出，表柔比星+L-OHP到表柔比星+5-FU的序貫聯合應用具有高效協同抑制人肝癌細胞株HepG2 的作用， 可以作為臨床應用的實驗依據，并為肝癌患者的化療及小劑量序貫化療提供參考。但本實驗為體外干預實驗，其結果有待于進一步的臨床驗證。

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編輯/哈濤