大腸癌唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型研究

賀佐梅，黃飛娟，周小青，吳正治，，4，5*，謝夢洲,2*

（1.湖南中醫藥大學中醫診斷國家重點學科，湖南省2011數字中醫藥協同創新中心，湖南長沙410007；2.抗腫瘤中藥創制技術湖南省工程研究中心，湖南長沙410007;3.廣東醫學院附屬福田醫院，廣東深圳518033；4.深圳大學第一附屬醫院，廣東深圳518035；5.深圳市老年醫學研究所，廣東深圳518020）

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大腸癌唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型研究

賀佐梅1，黃飛娟3，周小青1，吳正治1，3，4，5*，謝夢洲1,2*

（1.湖南中醫藥大學中醫診斷國家重點學科，湖南省2011數字中醫藥協同創新中心，湖南長沙410007；2.抗腫瘤中藥創制技術湖南省工程研究中心，湖南長沙410007;3.廣東醫學院附屬福田醫院，廣東深圳518033；4.深圳大學第一附屬醫院，廣東深圳518035；5.深圳市老年醫學研究所，廣東深圳518020）

〔摘要〕目的研究建立大腸癌（colorectal cancer，CRC)）唾液蛋白質指紋圖譜新型分子診斷模型。方法采集34例腸癌患者、45例健康志愿者（正常組）的唾液標本，用弱陽離子交換型（WCX）納米磁珠聯合基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技術進行檢測，獲得各標本的蛋白指紋圖譜。用Biomarker Wizard軟件分析所獲得的蛋白指紋圖譜找出差異蛋白，再用Biomarker Patterns 5.0.2建立鑒別診斷模型。結果共檢測到312個腸癌差異蛋白質峰，兩組比值大于3（腸癌/正常對照＞3，或者正常對照/腸癌＞3），其中有37個差異蛋白質峰有統計學意義（P＜0.05）；其中有7個差異蛋白質峰腸癌組表達上調，28個差異蛋白質峰腸癌組表達下調，有35個差異蛋白質峰有顯著差異（P＜0.01）。篩選建立了由m/z為2 501.26、4 779.95、3 140.39的3個差異蛋白峰組成的腸癌與正常組的診斷模型，該模型的靈敏度和特異度分別為88％（30/34）和98 ％ (44/45)；通過交叉驗證法進一步驗證診斷模型的可靠性，結果該模型的靈敏度和特異度分別為85％ (29/34)和88％ (37/45)。結論用WCX結合MALDI-TOF-MS技術建立的唾液蛋白診斷模型為腸癌的診斷提供了新途徑。

〔關鍵詞〕大腸癌；唾液；蛋白質組；分子診斷模型；蛋白指紋圖譜；基質輔助激光解析電離飛行時間質譜

大腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界范圍內男性和女性第三個常見的癌癥[1]，是胃腸道常見的惡性腫瘤，以41-65歲發病率最高[2]。腸癌如果早期發現5年生存率可達90％，而有轉移的進展期大腸癌其5年生存率低于10％[3]。

內窺鏡檢查仍然是大腸癌診斷的金標準，雖然內鏡設備得到了一次次升級變革，從傳統的全結腸電子內鏡到放大內鏡及染色內鏡、窄帶內鏡(NBI)、自發熒光內鏡(AFE)、共聚焦激光顯微內鏡(CEM)、超聲內鏡(EUS)、結腸膠囊內鏡(CCE)[4]等各項先進技術在內鏡中的應用，提高了分辨率，但仍然價格昂貴且對人體傷害較大，嚴重限制了大腸癌的早期診斷[5]。而新近發展起來的大腸癌腫瘤標志物檢測，單項指標檢測準確率低，多項指標聯合檢驗雖可一定程度上提高檢測的準確性，但結果的準確性（＜70％）仍不能滿足臨床診斷腸癌需要，且血液檢測亦為有創檢測[6]。目前為止還沒有一個快速、準確而又適合于大規模篩查的大腸癌早期診斷方法，因此，尋求一個簡便、快速、準確率高的無創傷檢查新方法勢在必行。

因此，本研究選用大腸癌患者唾液標本，運用弱陽離子交換型（WCX）納米磁珠芯片聯合基質輔助激光解析離子化飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技術，擬從唾液蛋白質組學變化探索腸癌的分子基礎并建立分子診斷模型。

1臨床資料

1.1病例選擇標準

1.1.1診斷標準大腸癌診斷標準：有明確的腸鏡下活檢病理和手術病理學確診的大腸癌[7]。

健康人標準：經病史、查體、常規心電圖、超聲心動圖、常規生化檢查未發現相關疾病者[8]。

1.1.2納入標準（1）符合診斷標準而且未經手術和放化療；（2）年齡在20-75歲之間；（3）自愿且能夠配合參加的受試對象。以上3項必須全部符合才能納入。

1.1.3排除標準（1）不符合上述診斷標準者；（2）年齡＜20或＞75歲者；（3）患有口腔局部及唾液腺的炎癥、消化道潰瘍、腫瘤及先天性疾??；患有舍格倫綜合征、囊性纖維病；患有其他系統嚴重并發疾病。1.1.4質量控制（1）釆用統一診斷標準、統一調查表格、統一調查方法；（2）調査者在調査時嚴格按照“標準化”執行,減少調查者偏倚,確保資料的一致性和真實性；（3）電子胃鏡及病理結果均由1月內三級甲等醫院診斷。

1.2病例來源

本研究共納入2014年12月-2015年04月在湖南省腫瘤醫院腸癌組患者34例，其中直腸癌20例，結腸癌13例，結直腸癌1例；男22例、女12例；年齡26～74歲，中位年齡58歲。正常對照組45 例,男28例、女17例；年齡23～72歲，中位年齡52歲，均來自于湖南中醫藥大學附屬第一醫院體檢科健康自愿者。所有病例均按照納入標準進行納入。

2實驗方法

2.1主要儀器和試劑

蛋白指紋圖譜（液體芯片）試劑盒（WCX磁珠、Wash Buffer、Elution Buffer、U9裂解液）及MALDITOF-MS（蛋白指紋圖譜儀I型），均為湖州賽爾迪生物醫藥科技有限公司產品，試劑盒批號為K20150501；dH2O（HPLC級）、CHCA為Sigma公司產品。

2.2樣品收集與預處理

按照本課題專用臨床觀察表進行臨床觀察記錄。取材前一天晚上臨睡前清水漱口三次（不再進任何食物和藥物），采用非刺激性唾液采集方式，第二天晨起漱口前空腹取材。由經過培訓的課題組專人取材,前5 min內的唾液自然吞下后開始收集，患者將已經過消毒的無菌小圓柱形棉花含入口中，口腔唾液積聚至一定量后，將該棉花吐入置于冰浴中的15 mL唾液離心管內，4℃下靜置1 h后，3 000 r/min、4℃下離心10 min，冰浴上分裝在1 mLEP管中，每管200 μL，于-80℃冰箱冷凍保存。實驗時取出樣本，冰上解凍，所有檢測唾液樣本均一次凍融。取5 μL唾液加入10 μL U9裂解液，混合孵育30 min后，加入185 μL Wash Buffer稀釋（唾液最終上樣量為2.5 μL）。

2.3納米磁珠預處理、上樣和洗脫

（1）取WCX納米磁珠50 μL加入到200 μLPCR管，置于磁鐵上孵育1 min（注意避免由于孵育時間過長導致磁珠結塊），去除上清液；（2）再依次加入100 μL Wash Buffer洗脫5 min，在磁鐵上孵育1 min，去除上清液；再重復操作本項步驟一次；（3）向每個裝有納米磁珠的PCR管中加入100 μL處理好的唾液樣品，混勻后，置于室溫孵育30 min，將PCR管置于磁鐵上孵育1 min，去除上清液；（4）每管加入100 μL Wash Buffer洗脫5 min，然后將PCR管置于磁鐵上孵育1 min，去除上清液；再重復操作本項步驟一次；（5）在PCR管中加入10 μL E-lution Buffer洗脫5 min（不能少于5 min），將PCR管置于磁鐵上孵育1 min，取5 μL上清液移至另一個PCR管中；（6）裝有5 μL上清液的PCR管中加入5 μL CHCA（基質）飽和溶液，充分混勻（混合到樣品顏色發灰，而沒有明顯的沉淀并及時上樣），取2 μL混合溶液（1 μL唾液樣品+1 μL基質）加樣到Au/Steel芯片上，待干后放入儀器讀取。

2.4芯片檢測、數據采集和參數設置

采用MALDI-TOF MS讀取芯片信息。設置激光強度為190，靈敏度為5，收集數據的質荷比（m/z）范圍為2 000～25 000 m/z，優化范圍為2 000 ～15 000 m/z，信號收集位置40～60，平均每點收集20次，收集總點為100次。已知多肽標準芯片標準（all-in-one），激光離子流0.5.用Ciphergen Proteinchip Software 3.2.1軟件自動采集數據，縱坐標為峰強度（蛋白相對含量），橫坐標為蛋白質質荷比（m/z）。

2.5數據分析

對位于2 000～25 000 m/z峰值，用Biomarker Wizard軟件過濾噪音。設置初始的噪音過濾值為5，二次信噪比為2，以10％為最小閾值進行聚類，經上述數據預處理后，采用t檢驗比較2組唾液蛋白質質譜數據（由Biomarker Wizard軟件完成），找出2組之間具有統計學意義的差異表達蛋白質峰。用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用決策樹算法計算出多個變量（m/z蛋白質質譜峰）變化對兩樣本的判別價值，確定最佳的篩選模型（即診斷模型）。

3結果

3.1數據分析及建立診斷模型

腸癌組、正常對照組兩組共79份唾液標本，經過標準化后，在相對分子質量為2 000～25 000 m/z范圍內共檢測到312個蛋白質峰，兩組比值大于3（腸癌/正常對照＞3，或者正常對照/腸癌＞3），其中有37個差異蛋白質峰有統計學意義（P＜0.05，見表1），28個差異蛋白質峰表達下調（典型下調對比圖譜，圖1-A、圖1-B），其中有7個差異蛋白質峰表達上調（典型上調對比圖譜，圖1-C），有35個差異蛋白質峰有顯著差異（P＜0.01）。

圖1　-A：m/z為2501的峰，上第1、2幅圖為腸癌組，下第3、4幅圖為正常對照組。與正常對照組相比，腸癌組表達下調。縱坐標為峰強度（蛋白相對含量），橫坐標為蛋白質質荷比（m/z）。圖1　-B：m/z為3140的峰,上第1、2幅圖為腸癌組，下第3、4幅圖為正常對照組。與正常對照組相比，腸癌組表達下調?？v坐標為峰強度（蛋白相對含量），橫坐標為蛋白質質荷比（m/z）。圖1　-C：m/z為4779的峰,上第1、2幅圖為正常對照組，下第3、4幅圖為腸癌組。與正常對照組相比，腸癌組表達上調。縱坐標為峰強度（蛋白相對含量），橫坐標為蛋白質質荷比（m/z）。圖1　腸癌組與正常對照組MALDI質譜峰圖

用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用決策樹算法計算出多個變量（m/z蛋白質質譜峰）變化對兩樣本的判別價值，確定最佳的篩選模型（圖2），最終選定m/z為2 501.26、4 779.95、3 140.39建立大腸癌與正常對照組的判別模型，該模型的靈敏度和特異度分別為88％（30/34）和98％(44/45)（表2）。

圖2　2 501.26、4 779.95和3 140.39三個差異峰組成的診斷模型

表1　腸癌組與正常組之間差異有統計學意義的蛋白質峰

當滿足條件以下條件之一者：①2 501.26 m/ z≤14.31且4 779.95 m/z＞8.82；②2 501.26 m/z≤14.31且4 779.95 m/z≤8.82、3 140.39 m/z≤3.09，提示為大腸癌標本；當滿足條件以下條件之一者：①14.31且4 779.95 m/z≤8.82、3 140.39 m/z＞3.09，提示為正常標本。M：質譜峰相對強度。

表2　所建診斷模型對腸癌的診斷效率（臨床回顧檢驗結果）

3.2診斷模型十字交叉驗證

對所建立的大腸癌診斷模型采用十字交叉法進行驗證，結果該模型的靈敏度和特異度分別為85％ (29/34)和88％(37/45)（表3）。十字交叉驗證的ROC曲線值為0.958（圖3-A、圖3-B），進一步的分析驗證了所建立模型的準確性。

表3　所建診斷模型對腸癌的診斷效率（十字交叉驗證結果）

圖3　-A，腸癌組十字交叉驗證的敏感性、特異性及ROC曲線。橫軸坐標為假陽性率(1-特異度)，縱坐標為真陽性率(靈敏度)。圖3　-B，正常對照組十字交叉驗證的敏感性、特異性及ROC曲線。橫軸坐標為假陽性率(1-特異度)，縱坐標為真陽性率(靈敏度)。圖3　腸癌組與正常對照組的鑒別診斷模型十字交叉驗證的ROC曲線

4討論

結直腸癌是常見腫瘤之一，肝臟是結直腸癌最常見、最易發生的轉移器官[9]，然而結直腸癌的早期診斷、與腸良性病變的鑒別以及判斷是否發生轉移尚缺乏有效手段。目前蛋白指紋圖譜技術在腸癌的研究主要有：大腸癌與正常人的鑒別診斷、大腸癌無轉移與大腸癌肝轉移（同時性肝轉移/異時性肝轉移）的鑒別、大腸良性病變與大腸癌鑒別，以及大腸癌預后模型等。采用蛋白質組學技術進行大腸癌研究，各研究者均得到敏感性、特異性、準確性較高的分子診斷模型，然而，各研究者所篩選得到的差異蛋白質峰差異很大。大腸癌與正常對照組的差異蛋白對比研究，柳俊剛等[10 ]發現m/z為3 223.43、7 971.57、11 493.00；崔丹瑜等[11]發現m/z為5 909、5 341、2 685、2 811、3 928、6 635、8 933；林建軍等[12]發現m/z為2 870.7、3 084.0、9 180.5、13 748.8；張巍等[13]發現為2 974、3 282、5 948、2 957、2 982、5 920、6 647、6 661；Liao CC等[14]發現1 800～16 000 Da范圍內的73個峰；Xu W[15]發現15個差異蛋白（2 900～9 000 Da）；周智勇等[16]發現26個下調蛋白、52個上調蛋白，范圍在4 000 Da～1 110 Da。大腸癌無轉移與肝轉移的差異蛋白對比研究，柳俊剛等發現m/z為3 223.43、3 511.88、8 894.49；崔丹瑜等發現在肝轉移組m/z為7 570、7 795、7 939、8 137、8 925、9 196、11 814、7 837低表達，而m/z為5 813蛋白點高表達。腸良性病變與大腸癌差異蛋白對比研究，Xu W等發現m/z為3 570、3 101、4 869在腺瘤組高表達，在大腸癌組低表達；張巍等發現m/z為3 016、66 172個蛋白點在兩組比較中差異顯著。李小瓊等[17]對正常組、良性病變組以及（術前）組三者的差異蛋白研究發現7個差異點，m/z分別為4 955、5 325、5 890、6 615、7 739、8 109、8 575。于新哲等[18]發現，.結直腸癌無轉移對比結直腸癌異時性肝轉移組,得到0個差異蛋白峰,無統計學差異(P>0.05)；結直腸癌異時性肝轉移組對比同時性肝轉移組,得到1個差異蛋白峰,m/z=4 355.26（P＜0.05）；由此可見，實驗可重復性不足，可能與實驗中樣品的預處理方法（芯片的種類、廠家、批號等）、試驗操作者技能水平、研究者所采取的質譜方法（MALDI、SELDI或其他）、數據分析方法（SVM、留一法等）等不一致有關。

現有研究多針對腸癌患者血液標本或者組織標本的有創檢測，受試者依從性差，不利于反復采樣、實時動態監測以及人群盲篩推廣，具有一定的限制性，不能廣泛應用。筆者從無創角度，采用唾液樣本進行腸癌的診斷研究，擬取得腸癌早期、無創診斷新方法。唾液取樣是一種快速、無創、安全、無痛苦的過程，唾液中大量物質能夠很好地反映人體全身狀態，是一種生物全息律的具體表現之一。唾液檢測可用于自身免疫系統疾病[19]、內分泌系統疾病[20]、心理學研究[21]等各系統疾病的診斷、療效監測及病情進展的研究，尤其在各系統腫瘤的研究頗多。研究發現大腸癌疾病與唾液中的B型內皮素受體（endothelin receptor type B，EDNRB）量有關聯[22]。因而，本課題設想可通過唾液中的特異生物標志物實現大腸癌的無創診斷。吳正治[23]等將唾液蛋白質組學技術運用于中醫舌苔原理與微觀辨證學的研究，發現不同舌苔與唾液蛋白質組具有相關性,并認為舌苔原理研究的進一步突破，有賴于以分子整體觀為基礎的技術方法學的突破。唾液由唾液腺產生，是消化系統的重要組成部分?！捌⒃谝簽橄?，腎在液為唾”，因而中醫認為唾液與脾腎密切相關，尤其是與脾胃密切相關。蛋白質是生命活動的表達者，而中醫病證各階段必有蛋白質為物質基礎，因此，推斷唾液中的某些生物標志物（蛋白質）能夠有助于中醫脾胃系統病證診斷的研究[24]。

本實驗將WCX與MALDI-TOF-MS技術相結合，進一步探索腸癌患者唾液差異表達蛋白，發現了312個腸癌差異蛋白質峰，兩組比值大于3（腸癌/正常對照＞3，或者正常對照/腸癌＞3），其中有37個差異蛋白質峰有統計學意義（P＜0.05），其中有7個差異蛋白質峰腸癌表達上調，28個差異蛋白質峰腸癌表達下調，有35個差異蛋白質峰有顯著差異（P＜0.01）。選取m/z為2 501.26、4 779.95、3 140.39建立腸癌組與正常對照組的判別模型，該模型的靈敏度（88％）和特異度（98％）均高，采用十字交叉驗證，靈敏度和特異度分別為85％、88％，可見，該模型對腸癌的診斷具有一定的價值。

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（本文編輯李杰）

Establishment of Saliva Protein Fingerprint Molecular Diagnostic Models for Screening Colorectal Cancer

HE Zuomei1, HUANG Feijuan3, ZHOU Xiaoqing1, WU Zhengzhi1,3,4,5*，XIE Mengzhou1,2*
（1. National Key Descipline of TCM Diagnosis, 2011 Collaborative Innovation Center of Digital Chinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha Hunan 410007, China; 2.Hunan Engineering Research Center for the Technology of Creation & Mannufacture of Chinese Medicine for Anti-tumor, Changsha Hunan 410007, China; 3. Futian Affiliated Hospital of Guangdong Medical Institute, Shenzhen, Guangdong 518033, China; 4.The Fist Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen, Guangdong 518035, China; 5.Shenzhen Institute of Geriatrics, Shenzhen, Guangdong 518020, China）

Abstract〔〕Objective To establish a novel molecular diagnostic model of saliva protein fingerprint in colorectal cancer (CRC) patients. Methods Saliva samples from 34 patients with CRC, and 45 healthy people were analyzed by weak cationicexchange magnetic beads (MB-WCX) and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDITOF -MS) methods. Subsequently, we compared the saliva peptide signatures of the two groups and obtained differently expressed peptides by using of Biomarker Wizard, then establish a diagnostic model to diagnose gastric carcinoma by using of Biomarker Patterns 5.0.2. Results 312 differentially expressed protein peaks were detected, the ratio of two groups>3.0 (CRC/control>3.0, or control/ CRC>3.0), including 37 protein peaks were statistically significant (P<0.05); 7 peaks were upregulated, 28 peaks were down -regulated, there were 35 different protein peaks have significant difference (P <0.01). Further more, we screened and built a saliva proteomic models with 3 protein molecules m/z 2501.26, 4779.95, 3140.39book=20,ebook=23to distinguish CRC groups and normal groups. The sensitivity of this model was 88％ (30/34), and the specificity was 98 ％ (44/45). The reliability of this model was further verified with a sensitivity of 85％ (29/34) and a specificity of 88％ (37/45) by cross validation method. Conclusion Saliva proteomic profiling by using MALDI-TOF-MS combined with WCX technique is a novel potential tool for the clinical diagnosis of CRC.

Keywords〔〕colorectal cancer; saliva; proteome; molecular diagnostic model; protein fingerprint; matrix -assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry

〔通訊作者〕*吳正治，男，博士，教授，博士研究生導師，E-mail: szwzz001@163.com。謝夢洲，女，博士，研究生，教授，碩士生導師，E-mail: xiemz64@qq.com。

〔作者簡介〕賀佐梅，女，碩士，研究方向為中醫診斷（消化系統病病證結合唾液蛋白質組學研究）。

〔基金項目〕國家自然科學基金項目資助（81273665）；湖南中醫藥大學中醫診斷學國家重點學科開放基金項目（201401）。

〔收稿日期〕2016-01-28

〔中圖分類號〕R735.3;R241

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.04.005