膽固醇酯轉運蛋白抑制劑的分子設計

劉炳旺，馬英，李彬寒，王潤玲

（1.天津醫科大學藥學院，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070；2.天津醫科大學腫瘤醫院分子影像及核醫學診療科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津 300060）

論著

膽固醇酯轉運蛋白抑制劑的分子設計

劉炳旺1，2，馬英1，李彬寒1，王潤玲1

（1.天津醫科大學藥學院，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070；2.天津醫科大學腫瘤醫院分子影像及核醫學診療科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津 300060）

目的：設計針對膽固醇酯轉運蛋白(CETP)的抑制劑，提高其降低血脂水平，為以后相關疾病的治療提供科學的方法和依據。方法：以現有torcetrapib抑制劑為模板，利用Schrodinger Suite 2009軟件中的“Core Hopping”模塊進行修飾，對修飾后的結構用“Core Hopping”模塊改造結構；利用Schrodinger Suite2009中的Glide模塊對druglike數據庫中10萬個化合物進行高通量虛擬篩選，得到結構進行修飾。利用Glide模塊對所建立的化合物庫進行虛擬篩選。應用Qikprop模塊做ADME（吸收、分布、代謝、排泄）預測來推測這些化合物的成藥可能性。結果:對torcetrapib結構進行修飾，得到8個較好的化合物；通過對druglike數據庫進行高通量虛擬篩選得到1個化合物-ZINC26608950，修飾后得到6個化合物。用分子對接方法分析了新抑制劑和CETP的相互作用機制，與現有的抑制劑torcetrapib相比有更好的結合能力。通過ADME預測得出設計出的化合物均符合類藥5原則。結論：通過兩種方法得到14個CETP抑制劑，分子對接初步證明其可以抑制CETP，此為CETP抑制劑的結構改造及活性測定奠定了基礎。

膽固醇酯轉運蛋白；抑制劑；藥物設計；分子對接

心血管疾病具有“發病率高、致殘率高、死亡率高、復發率高、并發癥多”的特點[1-2]，嚴重危害到人類健康，已位于人類死亡病因之首，而高血壓、冠狀動脈粥樣硬化是其病因之一。研究治療冠狀動脈粥樣硬化藥物對預防和治療心血管疾病有著重要意義[3]。研究發現膽固醇酯轉運蛋白（CETP）可作為治療動脈硬化的新靶點，一個基因突變致CETP缺乏的家系，高密度脂蛋白（HDL）水平升高，同時冠心病發病率明顯下降，并且當抑制CETP的活性時，能有效提高血漿內HDL含量水平[4-6]，所以CETP抑制劑被認為是冠狀動脈粥樣硬化(AS)最有治療潛力的藥物之一[7-12]。本研究旨在通過兩種方法-高通量虛擬篩選和結構修飾的方法設計出新的CETP抑制劑。

1 材料與方法

1.1 材料 軟件及數據庫在DELL T5500計算工作站上進行操作，涉及的軟件為Schrodinger 2009，模塊包括 ligPrep,QikProp,Combiglide,Glide。在ChemBioOffice2010上進行繪圖，片段分子來自已有碎片庫。受體來自PDBbank數據庫。

1.2 方法

1.2.1 受體結構的準備 蛋白結構預處理由Schrodinger Suite 2009軟件中的Protein preparation wizard模塊完成。首先對CETP蛋白質結構（PDB ID:4EWS）[13]進行修正，包括修正化學鍵，加氫，處理金屬離子，修正N端和C端的殘基結構錯誤，除去蛋白質晶體結構中的水分子和雜原子，只保留蛋白分子與原始配體。再對蛋白質氫鍵進行優化，優化參數為Sample water orientations，優化力場選擇OPLS 2005[14]，以RMSD 0.5 ?為收斂標準。

1.2.2 盒子的產生 以原始配體小分子torcetrapib為中心，大小選擇為11?生成對接盒子文件。為確保盒子文件能夠適合模擬體系，對盒子文件進行驗證。本實驗通過將小分子torcetrapib對接到CETP（4EWS）的配體結合區，再重新與晶體結構中的配體構象疊合比對來驗證對接方法和盒子文件的選擇是否合理。

1.2.3 配體準備 對分子進行配體優化處理，此步在 LigPre模塊中完成。小分子優化的力場為OPLS_2005，產生pH值7.0±2.0下的離子化狀態，去鹽，產生各種可能的互變異構體。

1.2.4 分子對接 應用Glide[15]模塊進行分子對接。以原始配體小分子為盒子中心，大小為11×11×11?自動生成對接盒子文件。虛擬篩選中對接精度為HTVS（高通量篩選）。對接精度為SP（標準精度），采用柔性對接，柔性對接時要求考慮各種環的柔性情況，要求對接函數在打分時對非平面型的酰胺鍵構象進行罰分，其它參數為默認值。

1.2.5 結構修飾 “Core Hopping”模塊具有片段替換和分子剛性對接兩大功能，可以發現全新的拓撲結構骨架和活性分子。在“Core Hopping”過程中，第一步是定義模板化合物，在Define Combinations step中定義需要替換的片段。第二步將定義好的受體盒子導入Receptor grid file中。第三步導入分子片段，分子片段來自于實驗室已有片段數據庫和軟件中自帶的片段數據庫。小分子片段會自動連接到母核上生成新的化合物數據庫，得到的化合物數據庫與受體進行剛性對接。依據對接得分進行下一步篩選，得分的絕對值越大，配體與受體的親和力越強，結合力越好。

1.2.6 ADME預測 QikProp模塊可以預測化合物，可以對整個分子的3D結構預測，預測性質包括：辛醇/水和水/氣體的log Ps,log S,log BB；整個CNS活性；Caco-2和MDCK細胞滲透性；血清白蛋白結合活性log Khsa；HERG的K離子通道阻斷性log IC50。本實驗對logPo/w、PSA、logS和PMDCK進行了預測。

2 結果

2.1 對接方法驗證 對接后的結構與晶體中配體原始構象的均方根偏差（RMSD）值為0.8 ?。說明盒子文件能夠適用模擬體系。圖 1為 CETP與torcetrapib的結合模式圖。

圖1 CETP與compound1、torcetrapib的結合模式圖Fig 1 The conformation obtained by docking torcetrapib and compound1 to CETP

2.2 CETP抑制劑

2.2.1 對torcetrapib結構進行修飾 本實驗選取torcetrapib作為結構修飾的母核。具體修飾過程如圖2所示：首先對A片段進行替換旨在找到結合更強的片段，找出2個優選片段A1、A2。然后，對B片段進行替換以期找到疏水作用更強的片段，找出4個優選片段B1、B2、B3、B4。這樣就產生了2×4=8個化合物。根據這個分子修飾的原則，表1中列出了修飾后的8個torcetrapib的類似物分子，包括torcetrapib本身在內的對接結果。

圖2 以torcetrapib為母核的結構修飾流程圖Fig 2 A flowchart to show the agonists design process of torcetrapib

2.2.2 高通量虛擬篩選 對druglike[16]數據庫中10 000個化合物進行篩選，選出能與受體CETP的4個結合口袋結合的化合物最后得到1個化合物ZINC26608950。此化合物能結合到第2,3,4口袋。由此，選ZINC26608950作為進一步修改的候選化合物。ZINC26608950的缺點是沒有向CETP受體的第一結合空腔延伸，沒能與CETP受體結合區形成較好的匹配，所以可以嘗試設計出能夠占據CETP受體4個結合區的高效抑制劑。對此結構應用“Core Hopping”進行結構改造得出6個較好的結構,見表1。具體修飾過程如圖3所示：在環上添加分子片段以提高與受體的疏水區的匹配性，找出6個優選片段R1、R2、R3、R4、R5和R6。對接結果顯示：分子結構與CETP具有較好的匹配性。圖4為torcetrapib、comp-vs#1與CETP結合模式圖。

圖3 對ZINC26608950的結構修飾流程圖Fig 3 A flowchart to show the agonists design process of ZINC26608950

圖4 Torcetrapib、comp-vs#1與CETP結合模式圖Fig 4 The conformation obtained by docking torcetrapib and comp-vs#1 to CETP

2.3 ADME預測結果 應用Schrodinger2009軟件包中的QikProp模塊對與藥效相關的5個性質進行預測。結果如表1所示。新設計的化合物的logPo/w、PSA、logS、PMDCK均在合理的范圍內。

表1 ADME預測和對接得分Tab 1 Physiochemical descriptors calculated by QP and docking score

3 討論

3.1 CETP受體抑制劑的設計 靶點的選擇對化合物的設計起到至關重要的作用。CETP靶點蛋白晶體結構從布魯克海文蛋白數據庫下載，遵循以下條件：所選靶點晶體結構為人源的；晶體結構中氨基酸殘基沒有突變；晶體結構分辨率小于2.6?[17]。

Torcetrapib[18]是由美國輝瑞公司研發的第一個CETP抑制劑，也是第一個進行大規模終點事件評價臨床試驗的CETP抑制劑。torcetrapib使收縮壓升高約5 mmHg，同時升高血鈉、碳酸氫鹽及醛固酮水平。似乎這些脫靶效應導致了死亡率的增加，后續研究顯示這些不良作用與CETP抑制機制無關，即其他CETP抑制劑不一定有這樣的作用。CETP抑制劑torcetrapib具有高脂溶性（cLogP=8.395），極低水溶性，這就使化合物產生了脫靶現象。torcetrapib有兩點不符合成藥五規則：分子質量超過500和高脂溶性。所以在設計化合物的時候要避免此現象產生。現今，一個成功用作口服藥物的化合物必須具有足夠的水溶性，以及和其臨床藥效相關的通透性。準確的ADME預測對進一步合成起到指導作用。本實驗設計的化合物 logPo/w、PSA、logS、PMDCK均在合理的范圍內。盡管logPo/w越高，結合能力越強，但不能過度地增強logPo/w水平，這樣會導致藥物在體內分布較差。這些化合物的創新性在于不僅均符合成藥五規則還能與CETP有很好的相互作用，在理論上這些化合物的結合能力超過torcetrapib。

分子對接初步證明其可以抑制CETP，具有理論活性，表明基于CETP治療冠狀動脈粥樣硬化具有一定可行性，為治療冠狀動脈粥樣硬化的先導化合物的結構改造及活性測定奠定了基礎。

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（2015-10-09收稿）

Designing novel inhibitors by targeting cholesteryl ester transfer protein

LIU Bing-wang1,2,MA Ying1,LI Bin-han1,WANG Run-ling1
（1.School of Pharmacy,Tianjin Medical University,Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnostics,Tianjin 300070,China；2.Department of Molecular Imaging and Nuclear Medicine,Cancer Institute and Hospital,Tianjin Medical University,National Clinical Research Center for Cancer,Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin 300060,China)

Objective：To develop highly active cholesteryl ester transfer protein（CETP）novel inhibitors to facilitate further research.Methods：In this study,torcetrapib was modified by means of“core hopping”;the small molecule drug-like database was screened by Glide of Schrodinger Suite 2009 and then was modified.It was further validated by the outcomes of their ADME (absorption,distribution, metabolism,and excretion)predictions that the new agonists could have high potential to become drug candidates.Results：Eight compounds were discovered to inhibit CETP based on torcetrapib by means of“core hopping”.One CETP inhibitor-ZINC26608950 was discovered by high throughput virtual screening,and 6 compounds were discovered to inhibit CETP based on ZINC26608950.It was observed by docking that these novel inhibitors had more favorable conformation for binding to the receptor than torcetrapib.It was predicted that the values for these novel candidates were all within the reasonable ranges.Conclusion：The binding affinity of the designed molecules is theoretically higher than the torcetrapib in CETP.And the new inhibitors may become potential drug hits.

cholesteryl ester transfer protein;inhibitors;computer aid design drug;molecular docking

R914.2

A

1006－8147（2016）02-0122-04

劉炳旺(1981-)，男，碩士在讀，研究方向：計算機輔助藥物設計；通信作者：王潤玲，E-mail:wangrunling@tijmu.edu.cn。