蒙藥嘎日迪-13對腦缺血損傷大鼠不同時相血清及腦組織不同腦區(qū)P-selectin含量及表達的影響

何靜波 張浩楠 田彩云 鄭延澤 武海軍 楊玉梅

(包頭醫(yī)學院，內蒙 包頭 024000))

蒙藥嘎日迪-13對腦缺血損傷大鼠不同時相血清及腦組織不同腦區(qū)P-selectin含量及表達的影響

何靜波 張浩楠 田彩云 鄭延澤 武海軍 楊玉梅*

(包頭醫(yī)學院，內蒙 包頭 024000))

目的：研究蒙藥嘎日迪-13對腦缺血損傷大鼠不同時相血清中P-selectin含量及腦中P-selectin表達量的影響。方法:360只雄性SD大鼠隨機分為腦缺血模型組、假手術組、嘎日迪-13大、中、小劑量組，每組又隨機分為6個時相組即1 h、6 h、12 h、24 h、72 h與120 h組，灌胃給藥，1次/d，連續(xù)27天后，線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型，進行神經功能評分后取材測定血清中P-selectin含量，免疫組化法測定腦組織中P-selectin的表達。結果:與假手術組比較，模型組大鼠神經功能評分、血清中P-selectin含量、腦組織中P-selectin表達量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，噶日迪-13給藥組可明顯降低腦缺血大鼠神經功能評分、血清中P-selectin含量、腦組織中P-selectin表達量(P<0.01或P<0.05)。結論:蒙藥嘎日迪-13可明顯降低血清中P-selectin含量、腦組織中P-selectin表達量，提示蒙藥嘎日迪-13抑制炎癥因子P-selectin表達可能是其對腦缺血保護作用的機制之一。

蒙藥；嘎日迪-13；腦缺血；大鼠； P-selectin

蒙藥嘎日迪-13由甘草、石菖蒲、沉香、肉豆蔻、磁石(煅)、木香、麝香、草烏(制)、訶子、珊瑚(制)、丁香和禹良土13味藥組成，是蒙醫(yī)常用的治療心腦血管疾病和神經系統(tǒng)疾病的傳統(tǒng)方劑之一，主治半身不遂、左癱右瘓、口眼歪斜、言語不清、筋骨疼痛、神經麻痹、風濕、關節(jié)疼痛、四肢麻木、腰腿不利等癥狀。藥理實驗和臨床研究表明[1-6]，蒙藥嘎日迪-13對缺血性腦損傷具有明顯的保護作用。

腦缺血再灌注損傷與黏附分子介導的白細胞、內皮細胞黏附關系密切，選擇素是近年來新定義的一類細胞黏附分子。實驗研究表明，當腦缺血再灌注時P-selectin表達上調，白細胞在P-selectin的介導下從血中遷移至腦組織，釋放有害物質，進而造成腦組織損傷[7]。

本研究通過測定腦缺血后大鼠不同時相血清中P-selectin的含量、不同腦區(qū)P-selectin表達量的影響，探討腦缺血后嘎日迪-13的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑：嘎日迪-13，內蒙古奧特奇蒙藥股份有限公司(金山)蒙藥廠，批號：080905；戊巴比妥鈉，佛山市化工實驗廠進口分裝，批號：860901；青霉素(400萬u/瓶)，華北制藥公司；P-selectinELISA試劑盒，上海彩佑試劑公司；P-selectin免疫組化試劑盒，北京博奧森；PV-6000通用型二抗試劑盒，6mL；ZLI-9018 DAB kit 3mL；PBS緩沖液(0.01M;pH=7.2～7.4)；檸檬酸鹽修復液(pH=6.0；0.01M)。其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器：RT-6000全自動酶標儀，美國雷杜公司；RT-2600C自動洗板機，美國雷杜公司；MTS 2/4酶標板振蕩器，德國IKA公司；Leica 2135石蠟病理切片機，德國Leica公司；YB-7B病理組織包埋機，安徽電子科學研究所；ZT-12P生物組織自動脫水機，湖北亞光醫(yī)用電子技術有限公司；QP切片漂烘儀，安徽電子科學研究所；Leica激光共聚焦顯微鏡，德國Leica公司； TG16-WS臺式高速離心機，湖南湘儀離心機有限公司。

1.3 實驗動物：SD大鼠，雄性，清潔級，360只，體重200±50g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，許可證編號：SCXK(京)2011-0012。環(huán)境溫度為22～26℃，按每籠6只飼養(yǎng)，試驗期間各鼠均自由進行飲水攝食。

2 方法

2.1 動物分組及模型制備：360只雄性SD大鼠隨機分為：腦缺血模型組(vehicle control，n=72)，假手術組(n=72)，嘎日迪-13大劑量組(Garidi13 large dose group，Garidi L,n=72)1.2g/100mL，嘎日迪-13中劑量組(Gridi13 middle dose group，Garidi M,n=72)0.6g/100mL，嘎日迪-13小劑量組(Garidi13 small dose group，Garidi S,n=72)0.3g/100mL，每個劑量組下分6個時相即1h、6h、12h、24h、72h與120h。各組大鼠均進行灌胃給藥(2mL/100g，模型組與假手術組給予等體積生理鹽水)，連續(xù)27d，1次/d，末次給藥后1h開始造模。模型制備采用改良Zea Longa[8]等的線栓法加以改良制作大腦中動脈缺血模型。

2.2 神經功能評分:采用Zea Longa[8]五級評分標準對大鼠進行神經功能評分。

2.3 取材:于規(guī)定時間點眼眶取血，室溫放置2h，離心(3000r/min)取血清凍存?zhèn)溆?；?%戊巴比妥鈉(0.1mL/100g)麻醉大鼠，開胸暴露心臟，用室溫生理鹽水通過左心尖部，沿升主動脈灌注沖血，同時剪開右心耳，可見右心耳流出液體的顏色逐漸由鮮紅色變?yōu)榈t色,至基本無色為止，換4%甲醛灌流，至大鼠肢體、尾巴僵直，即表明固定成功。開顱取腦，缺血側腦組織樣本放置于4%甲醛內固定24h。

2.4 指標檢測

2.4.1 血清中P-selectin含量測定：嚴格按照試ELISA劑盒說明書操作。

2.4.2 免疫組化檢測大鼠缺血腦組織不同區(qū)域P-selectin表達：將固定好的腦組織樣本沖洗脫水后用石蠟包埋，切成3～4μm薄片，65℃烤片1h待用，其余步驟嚴格按照試劑盒說明書嚴格操作，顯微鏡下觀察。 P-selectin陽性反應為細胞漿棕黃色深染，高倍鏡下(×400)隨機觀察缺血區(qū)域不重疊的5個視野，計數(shù)P-selectin胞漿陽性細胞數(shù)，取平均值。

3 結果

3.1 神經功能評分結果:與假手術組比較，各時相腦缺血模型組神經功能評分明顯升高(*P< 0. 01)，說明大鼠局灶性腦缺血模型制作成功；各時相嘎日迪-13大、中、小劑量組與模型組比較，神經功能評分明顯降低(**P< 0. 01)；各劑量組之間比較，神經功能評分不存在顯著差別(***P>0. 05)。見表1。

表1 嘎日迪-13在不同時相對局灶性腦缺血大鼠神經功能評分的影響

注：圖示為均數(shù)±標準差。與假手術組比較*P<0.01；與模型組比較**P<0.01。

3.2 嘎日迪-13對腦缺血大鼠血清中不同時相P-selectin含量變化的影響:與假手術組比較，各時相腦缺血模型組大鼠血清中P-selectin含量明顯升高(P< 0. 01)；與腦缺血模型組比較，各時相扎沖-13味大、中、小劑量劑量組大鼠血清中P-selectin含量明顯降低(P<0. 05)；劑量組各時相之間比較，大鼠血清中P-selectin含量不存在明顯差別(P>0. 05)。見表2。

表2 扎沖-13味在不同時相對局灶性腦缺血大鼠血清中P-selectin含量的影響

注：為均數(shù)±標準差。與假手術組比較※※P<0.01；與模型組比較##P<0.01。

3.3 嘎日迪-13對腦缺血大鼠不同腦區(qū)P-selectin表達的影響

3.3.1 嘎日迪-13對腦缺血大鼠大腦海馬中P-selectin表達的影響:與假手術組比較，各時相腦缺血模型組大鼠海馬中P-selectin表達量明顯升高(P< 0. 01)；與腦缺血模型組比較，12h、24h、72h、120h時相嘎日迪-13大、中、小劑量劑量組大鼠海馬中P-selectin表達量明顯降低(P<0. 01)，1h和6h時相組大、中劑量劑量組大鼠海馬中P-selectin表達量明顯降低(P<0. 01)；劑量組各時相之間比較，中劑量組1h時相組大鼠海馬中P-selectin表達量不存在明顯差別(P>0. 05)。見表3。

表3 嘎日迪-13在不同時相對局灶性腦缺血大鼠海馬中P-selectin表達量的影響

注：圖示為均數(shù)±標準差。與假手術組比較1)P<0.01；與模型組比較2)P<0.01。

3.3.2 嘎日迪-13對腦缺血大鼠大腦紋狀體中P-selectin表達的影響：與假手術組比較，各時相腦缺血模型組大鼠紋狀體中P-selectin表達量明顯升高(P< 0. 01)；與腦缺血模型組比較，各時相嘎日迪-13大、中、小劑量劑量組大鼠紋狀體中P-selectin表達量明顯降低(P<0. 01)；1h、6h時相各劑量組各時相之間比較，大鼠紋狀體中P-selectin表達量無明顯差異(P>0. 05)；嘎日迪-13大劑量劑量組與中、小劑量組比較，大鼠紋狀體中P-selectin表達量明顯降低(P<0. 01)。見表4。

表4 嘎日迪-13在不同時相對局灶性腦缺血大鼠紋狀體中P-selectin表達量的影響

注：圖示為均數(shù)±標準差。與假手術組比較※※P<0.01；與模型組比較##P<0.01。

3.3.3 嘎日迪-13對腦缺血大鼠大腦皮質中P-selectin表達的影響： 與假手術組比較，各時相腦缺血模型組大鼠大腦皮質中P-selectin表達量明顯升高(P< 0. 01)；與腦缺血模型組比較，12h、24h、72h、120h時相嘎日迪-13大、中、小劑量劑量組大鼠大腦皮質中P-selectin表達量明顯降低(P<0. 01)，1h和6h時相組嘎日迪-13大、中劑量劑量組大鼠大腦皮質中P-selectin表達量明顯降低(P<0. 01)；劑量組各時相之間比較，中劑量組1h時相組大鼠大腦皮質中P-selectin表達量不存在明顯差別(P>0. 05)。見表5。

表5 嘎日迪-13在不同時相對局灶性腦缺血大鼠大腦皮質中P-selectin表達量的影響

注：圖示為均數(shù)±標準差。與假手術組比較※※P<0.01；與模型組比較##P<0.01#P<0.05。

4 討論

腦缺血損傷后，炎性細胞因子的表達和炎性細胞浸潤可誘發(fā)一系列炎癥反應而加重腦組織損傷。炎癥因子可以作用于血管內皮，引起腦水腫，并破壞血腦屏障的正常生理結構和功能，而炎癥反應可引起局部腦血管痙攣或栓塞，進一步加重腦組織缺血缺氧。經過大量實驗研究表明提示炎癥反應對缺血腦組織是一把雙刃劍，早期的炎癥反應會加重神經細胞的損害作用[9]，而晚期炎癥反應有益于神經細胞的再生和恢復[10]。在針對腦缺血再灌注損傷的研究中已經證實，腦缺血后腦組織出現(xiàn)病理改變，缺血程度較輕的部位大多出現(xiàn)細胞凋亡，而缺血程度較重的部位則出現(xiàn)細胞壞死；目前針對腦組織病理形態(tài)學學研究較多的是腦組織的海馬、紋狀體、大腦皮層等區(qū)域。

P-selectin是存在于血小板和內皮細胞細胞膜上的跨膜糖蛋白，通常儲存于內皮細胞的分泌顆粒中， 表達于活化的內皮細胞和，活化的血小板經刺激后數(shù)分鐘內即遷移到內皮細胞表面,主要參與介導白細胞和內皮細胞的起始粘附，在白細胞黏附的前期起著重要作用。研究表明[11],血小板上的P-selectin在腦缺血時能通過增加血管內皮細胞與血小板相互作用或血小板聚集,使中性粒細胞移行和黏附,促進微血栓在損傷組織的毛細血管內形成。在缺血性腦損傷中，P -selectin介導了起始黏附作用，作用時間短暫且是可逆的，E-selectin則介導了持續(xù)性的粘附作用。

本實驗中，腦缺血后模型組大鼠神經功能評分和血清P-selectin含量及腦內P-selectin表達明顯升高，表明腦缺血模型建立成功，嘎日迪-13各給藥組血清P-selectin及其在不同腦區(qū)的表達顯著降低，表明嘎日迪-13保護腦缺血作用機制可能為抑制炎癥因子，而抑制P-selectin表達是其有效機制之一。

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2016年9月22日收稿

國家自然科學基金項目，編號81160560

何靜波，女，碩士研究生;研究方向：心腦血管與中蒙藥藥理研究;E-mail:63403584@qq.com，Tel:13948420925

*通訊作者：楊玉梅, 女，教授，Tel:13847230457,E-mail:yym457@aliyun.com

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1006-6810(2016)12-0034-04