慢性乙型肝炎患者基因耐藥變異特征分析

曹靈芝++樊正勤++趙耘

【摘要】 目的 探討慢性乙型肝炎（CHB）患者應(yīng)用核苷（酸）類似物（NAs）治療后基因耐藥變異的類型及與具體NAs、使用方法的相關(guān)性。方法 37例NAs治療中出現(xiàn)病毒學(xué)反彈病例作為研究對(duì)象， 檢測(cè)抗乙肝病毒（HBV）基因耐藥變異位點(diǎn)， 分析HBV耐藥基因變異類型與初始應(yīng)用NAs具體藥物及使用方法的相關(guān)性。結(jié)果 檢測(cè)出耐藥位點(diǎn)陽(yáng)性共35例：?jiǎn)嗡幹委熃M26例， 序貫治療組9例；單個(gè)位點(diǎn)突變14例， 兩個(gè)位點(diǎn)突變16例， 三個(gè)位點(diǎn)突變5例。結(jié)論 各種NAs均會(huì)出現(xiàn)不同程度的耐藥變異， 具有較高耐藥屏障的藥物發(fā)生耐藥的可能性較低。

【關(guān)鍵詞】 慢性乙型肝炎；耐藥；核苷（酸）類似物

CHB治療在近年中有了長(zhǎng)足的進(jìn)步， 主要?dú)w功于口服NAs的應(yīng)用。HBV治療過(guò)程中， 隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)， 往往會(huì)出現(xiàn)病毒耐藥株， 影響抗病毒治療應(yīng)答[1]。與未發(fā)生耐藥的患者比較， 耐藥不僅可導(dǎo)致疾病進(jìn)展， 還會(huì)加大治療難度， 增加醫(yī)療成本[2]。因此， 如何及時(shí)靈敏地預(yù)測(cè)耐藥株的出現(xiàn)， 為臨床醫(yī)生提供最佳替換治療方案或重新選擇治療時(shí)機(jī)顯得尤為重要。作者對(duì)NAs治療中出現(xiàn)病毒學(xué)反彈的37例CHB患者， 應(yīng)用HBV RT區(qū)擴(kuò)增及測(cè)序， 檢測(cè)HBV基因耐藥變異位點(diǎn)， 檢測(cè)出耐藥位點(diǎn)陽(yáng)性共35例， 分析其病毒變異耐藥與初始使用NAs種類、耐藥后加藥或換藥方案的相關(guān)性進(jìn)行分析， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2013年6月～2015年6月在本院就診的NAs治療中出現(xiàn)病毒學(xué)反彈的符合入組條件的37例患者中， 檢測(cè)出耐藥位點(diǎn)的共35例為研究對(duì)象， 其中男26例， 女9例， 年齡24～69歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲， 乙肝表面抗原（HBsAg）陽(yáng)性>6個(gè)月；②抗病毒治療指征符合《2010年中國(guó)慢性乙型肝炎防治指南》[3]；③連續(xù)使用NAs治療至少6個(gè)月， 并于入組時(shí)仍在使用；④血清HBV DNA水平≥3log 10 copies/ml；⑤無(wú)NAs應(yīng)用的禁忌證。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前6個(gè)月內(nèi)應(yīng)用過(guò)干擾素或其他免疫調(diào)節(jié)劑；②其他病毒重疊感染；③器官移植術(shù)后；④同時(shí)合并其他嚴(yán)重疾病， 包括合并其他肝病；⑤同時(shí)感染丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒；⑥酒精或其他成癮物質(zhì)濫用；⑦妊娠和（或）哺乳期。

1. 2 方法

1. 2. 1 分組 按服藥不同分為：①單藥治療組：拉米夫定（LAM）、阿德福韋酯（ADV）、替比夫定（LdT）、恩替卡韋（ETV）組； ②序貫治療組；按突變位點(diǎn)數(shù)分為：?jiǎn)蝹€(gè)位點(diǎn)突變組、兩個(gè)位點(diǎn)突變組、三個(gè)位點(diǎn)突變組。各組患者均為首次單藥治療， 耐藥后序貫治療， 按藥品說(shuō)明書(shū)按時(shí)服藥。

1. 2. 2 檢測(cè)方法 HBV-DNA采用美國(guó)MX3000P核酸擴(kuò)增實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)， 試劑由上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司提供， 結(jié)果以<500 copies/ml為陰性。

血清HBV RT區(qū)擴(kuò)增及測(cè)序：采用美國(guó)生物應(yīng)用公司ABI3500XL基因測(cè)序儀及ABI原裝試劑進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序。序列的生物信息學(xué)分析：采用Chromas 2和 Sequence Scanner v1.0軟件進(jìn)行RT區(qū)序列分析。

2 結(jié)果

2. 1 按照使用藥物分組情況 ①單藥治療組26例：?jiǎn)斡肔AM 16例， 檢測(cè)到M204I 7例， M204V 1例， L180M+M204I

3例， V173L+L180M+M204I/V 1例， L180M+M204V 2例， A181T+ N236T 1例， T184I+M204I 1例；單用LdT 5例， 檢測(cè)到M204I 3例， A181T+M204I 1例， L180M+M204I 1例；單用ADV 4例， 檢測(cè)到A181T 1例， A181T+M204V 1例， A181T/V+N236T 1例， N236T 1例；單用ETV 1例， 為L(zhǎng)180M+T184L+M204V。②序貫治療組9例：LAM序貫ETV 1例， 為V173L+M204I；LAM序貫ADV 3例， 檢測(cè)到V173L+L180M+M204I/V 1例，

A181T+N236T 1例， A181T/V/S 1例；ADV序貫ETV 1例， 為L(zhǎng)180M+T184L+M204V；ADV序貫LAM 2例， 檢測(cè)到V173L+ L180M+M204I 1例， L180M+M204V 1例；LAM、ADV、ETV三藥序貫1例， 為L(zhǎng)180M+M204V；LAM、LdT、ETV三藥序貫1例， 為A181T。

2. 2 按照耐藥基因變異位點(diǎn)分組情況 ①單個(gè)位點(diǎn)突變14例， 分別為：M204VI 10例， 7例與LAM相關(guān)， 3例與LdT相關(guān)；M204V 1例， 與LAM相關(guān)；A181T 2例， 1例與ADV有關(guān)， 1例為L(zhǎng)AM、LdT、ETV三藥序貫；N236T 1例， 與ADV有關(guān)。② 兩個(gè)位點(diǎn)突變16例， 分別為：L180M+M204I 4例， 3例與LAM有關(guān)， 1例與LdT有關(guān)；L180M+M204V 4例， 2例與LAM有關(guān)， 1例為ADV序貫LAM， 1例為L(zhǎng)AM、ADV、ETV三藥序貫；A181T+M204I 1例， 與LdT有關(guān)；A181T+M204V 1例， 與ADV有關(guān)：A181T+N236T 2例， 其中1例與LAM有關(guān)， 1例為L(zhǎng)AM序貫ADV；A181T/V+N236T 1例， 與ADV有關(guān)；A181T/V/S 1例， 為L(zhǎng)AM序貫ADV；T184I+M204I 1例， 與LAM有關(guān)；V173L+M204I 1例， 為L(zhǎng)AM序貫ETV。③三個(gè)位點(diǎn)突變5例， 分別為：V173L+L180M+M204I 1例， 為ADV序貫LAM；V173L+L180M+M204I/V 2例， 其中1例為單用LAM， 1例為L(zhǎng)AM序貫ADV；L180M+T184L+M204V 2例， 其中1例為單用ETV， 1例為ADV序貫ETV。

3 討論

NAs主要通過(guò)抑制HBV 聚合酶區(qū)（P區(qū)）活性， 阻止HBV復(fù)制過(guò)程中以HBV 的前基因組RNA為模板， 逆轉(zhuǎn)錄生成新的病毒DNA， 從而發(fā)揮抑制病毒復(fù)制的作用。由于抑制HBV 復(fù)制需要一個(gè)長(zhǎng)期的治療過(guò)程， 在抗病毒藥物的作用下， 野生病毒株由于選擇性壓力被抑制， 生存下來(lái)的突變株占優(yōu)勢(shì)， 最終導(dǎo)致病毒對(duì)藥物的敏感性下降， 病毒復(fù)制能力恢復(fù)[4]。在CHB患者體內(nèi)HBV 復(fù)制效率高， 每天可產(chǎn)生1012～1013個(gè)病毒顆粒；HBV 聚合酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶， 缺乏校正功能， 且錯(cuò)配率極高[5]。

目前用于治療CHB的NAs主要有5種：LAM、ADV、LdT、ETV和替諾福韋酯（TDF）。這些藥物耐受性良好， 能有效地抑制病毒復(fù)制， 主要缺點(diǎn)是停藥后病毒學(xué)復(fù)發(fā)率高， 長(zhǎng)期治療又有可能致耐藥突變。

本研究選取的符合入組條件的病例37例中35例檢出不同位點(diǎn)變異， 檢出的耐藥突變可以明確與藥物使用有關(guān)。其中單用LAM 16例（45.7%）， 與LAM使用時(shí)間長(zhǎng)、耐藥屏障低相符， LdT、ADV亦有相關(guān)的耐藥病例， 與ETV相關(guān)的耐藥有5例， 其中初始治療單用ETV耐藥僅1例， 其余4例為L(zhǎng)AM、LdT、ADV耐藥后序貫ETV后發(fā)生。以上研究結(jié)果說(shuō)明， 在本市CHB患者中已出現(xiàn)對(duì)NAs多種類型耐藥， 在NAs治療過(guò)程中出現(xiàn)病毒學(xué)突破的病例進(jìn)行P區(qū)耐藥位點(diǎn)檢測(cè)陽(yáng)性率較高， 可檢出與用藥相關(guān)的多種類型的突變。必須重視NAs規(guī)范化使用， 及時(shí)發(fā)現(xiàn)耐藥， 避免不必要的治療， 從而可以更好的指導(dǎo)下一步治療方案的調(diào)整， 讓患者能夠得到更好的遠(yuǎn)期病毒學(xué)結(jié)局。

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[收稿日期：2016-01-29]