RNAi下調FAK基因對大腸癌細胞SW620侵襲及轉移能力的影響毛

賀輝+陳燕紅+蘇國強

【摘要】 目的 觀察應用RNAi技術下調局部粘著斑激酶（FAK） 基因表達對SW620細胞侵襲及轉移能力的影響。方法 利用前期構建的針對FAK基因有效的短發夾RNA （shRNA ）序列的慢病毒表達載體， 包裝慢病毒并感染人結腸癌細胞SW620。運用免疫印記（Western-blot）從蛋白水平檢測FAK基因的表達， Transwell小室模型分別檢測敲減FAK基因表達對SW620細胞的侵襲及轉移能力的影響。結果 用慢病毒敲減FAK后的大腸癌細胞， 蛋白水平FAK表達明顯下調， SW60細胞的侵襲及轉移能力均受到明顯抑制。結論 下調FAK的表達水平， 能明顯抑制大腸癌SW620細胞的侵襲及轉移能力。

【關鍵詞】 慢病毒；局部粘著斑激酶；SW620；人結腸癌細胞；短發夾RNA

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.14.212

Influence by RNAi down-regulated FAK gene on invasion and metastasis ability in colorectal cancer cell SW620 MAO He-hui， CHEN Yan-hong， SU Guo-qiang. Department of Surgery， Xiamen City Maternal and Child Health Care Hospital， Xiamen 361003， China

【Abstract】 Objective To observe influence by RNAi down-regulated focal adhesion leinase （FAK） gene on invasion and metastasis ability in colorectal cancer cell SW620. Methods Lentivirus packaging was made by expression vector of short hairpin RNA （shRNA） sequence established for FAK gene， and human colon cancer cell SW620 was infected. Western-blot was applied to detect FAK gene expression from protein level， and Transwell cell model was used to detected influence by FAK gene knock-down expression on invasion and metastasis ability in SW620. Results In colorectal cancer cell after FAK gene knock-down by lentivirus， protein FAK expression was reduced， while invasion and metastasis ability in SW620 were obviously suppressed. Conclusion Invasion and metastasis ability in colorectal cancer cell SW620 can be remarkably suppressed by down-regulated FAK expression.

【Key words】 Lentivirus； Focal adhesion leinase； SW620； Human colon cancer cell； Short hairpin RNA

大腸癌主要以手術和化療治療， 但是對復發轉移患者， 傳統治療療效較差， 近年來， 靶向治療成為研究熱點。FAK作為細胞傳導中的重要信號分子， 參與細胞增殖、轉移， 如果可以抑制FAK基因的表達， 理論上能降低腫瘤的增殖活性、侵襲及轉移能力。既往研究提示， 抑制細胞內FAK基因表達， 可明顯降低乳腺腫瘤及卵巢腫瘤細胞的侵襲和轉移能力 [1， 2]。前期試驗中成功構建了FAK shRNA重組慢病毒質粒， 并制備相應的慢病毒感染人大腸癌細胞SW620[3]， 下調其FAK基因表達， 觀察對大腸癌細胞SW620侵襲、轉移能力的影響， 為動物體內實驗打下基礎。現報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 人大腸癌細胞株SW620由廈門大學李博安教授惠贈；Tranwell小室購自Millipore公司；Trizol、Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；RNase-free購自大連寶生公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清等購自Hyclone公司；細胞培養板及計數板均購自Costar公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 細胞培養及轉染Western blot法檢測FAK蛋白表達 實驗分為1組感染表達FAK-shRNA（實驗組）， 2組感染無關序列shRNA， 3組正常SW620細胞。病毒感染后2 d的細胞中提取各組等量蛋白， 將蛋白轉到PVDF膜， 使用已制備的封閉液室溫封閉1 h。用一抗在4℃下與PVDF膜孵育過夜。TBST洗膜3次， 加入與一抗相對應的二抗， 在搖床上室溫孵育1 h。TBST洗膜3次， 然后顯色、攝影。

1. 2. 2 細胞侵襲、轉移實驗 Transwell小室制備：①包被基底膜：用50 mg/L Matrigel稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面， 4℃風干。②水化基底膜：吸出培養板中殘余液體， 加入50 μl/孔含10 g/L BSA的無血清培養液， 37℃， 30 min。制備細胞懸液：消化細胞， 終止消化后離心棄去培養液， PBS洗

2次， 用含BSA的無血清培養基重懸， 調整細胞密度至5×104個/ml。接種細胞：①取細胞懸液1 ml加入Transwell小室。②6孔板下室加入2 ml含10%FBS的培養基。③37℃、5%CO2條件下繼續培養24 h。穿膜細胞計數：取出Transwell小室， 用棉簽擦去Matrige膠和上室內的細胞， 0.1%結晶紫染色1 h， 雙蒸水沖洗Transwell小室膜， 然后將其解下， 反面貼于載玻片上， 倒置顯微鏡下計數， 100倍下取5個視野， 計數后取平均值。

1. 3 統計學方法 采用SPSS14.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 SW620細胞FAK蛋白表達 實驗組（轉染FAK shRNA重組慢病毒）與感染陰性對照組和正常SW620細胞進行比較， 其FAK蛋白表達水平明顯降低。見圖1。

1. 實驗組；2. 感染陰性對照組；3. 正常SW620細胞。

圖1 Western blot法檢測FAK蛋白表達

2. 2 Transwell小室侵襲實驗 實驗組穿膜細胞數（63.9±8.6）明顯少于陰性對照組（98.4±11.9）（P<0.05）， 陰性對照組（98.4±11.9）與未處理組（105.4±14.1）比較， 差異無統計學意義（P=0.181>0.05）。見圖2。

圖2 敲減FAK基因表達抑制SW620細胞的侵襲能力

3 討論

腫瘤發生侵襲、轉移是一個多基因參與的復雜的多步驟過程。在腫瘤轉移過程中， 腫瘤細胞通過表達基質金屬蛋白酶和乙酰肝素酶降解基底膜[4]， 這需要通過復雜的細胞信號轉導來實現。

RNAi是一種基因沉默技術， 目前廣泛應用于腫瘤研究領域， 其作用機制：核酸內切酶（Dicer）將DsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段RNA（大約21～23 bp）， 即siRNA， 然后siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈， 反義siRNA再與體內一些酶（包括內切酶、外切酶、解旋酶等）結合形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex， RISC）。由RISC介導切割靶mRNA分子中與siRNA反義鏈互補的區域， 從而達到干擾基因表達作用。

FAK通過調控細胞周期來促進腫瘤細胞增殖[5]。有研究顯示， 主要有3條信號傳導通路共同作用于FAK， 然后再通過一系列信號傳導， 誘導周期素D1和周期蛋白依賴性蛋白激酶高表達， 由此加快細胞從G1期進入S期， 促進細胞增殖 [6]， 這三條通路包括：①FAK-Ras-MAPK；②FAK-P130cas-Crk-JNK-C-Jun；③FAK-PI3K-AKT通路。Lin [7]研究發現沉默FAK基因， 抑制FAK-P130cas-Crk-JNK-C-Jun信號通路， 使正常鼠的成纖維細胞NIH3T3停滯在G1， 無法進入S期， 明顯影響該成纖維細胞的生長。Sonoda等[8]下調黑色素瘤細胞FAK基因表達， 抑制FAK-PI3K-AKT信號通路， 降低細胞周期蛋白D1和周期蛋白依賴性蛋白激酶4表達， 明顯抑制黑色素瘤細胞增殖。FAK在腫瘤細胞的侵襲和轉移中扮演著重要角色。其是細胞信號傳導通路中的上游因子， 主要通過以下3條信號傳導通路促進細胞侵襲、轉移[9]：①FAK/Src信號傳導通路。②FAK/PI3K信號通路。③FAK/Rho信號傳導通路。Hauck 等[10]研究表明沉默FAK基因， 可抑制上述3條信號傳導通路， 發現其研究的腫瘤細胞侵襲能力明顯下降。Su 等[11]應用RNA干擾技術， 沉默胃癌SGC7901細胞FAK基因， 抑制胃癌細胞SGC7901增殖、侵襲和轉移， 同時可以抑制動物體內胃癌生長， 減低遠處轉移的風險。Egawa等[12]下調FAK表達水平， 成功抑制膀胱癌細胞侵襲、轉移等能力。本項研究的結果也表明下調FAK基因的表達水平， 大腸癌細胞SW620侵襲及轉移能力明顯下降， 這將為今后大腸癌的靶向治療提供新的靶點。

總之， 利用前期構建的pLentilox3.7-shFAK， 制備相應的病毒， 感染大腸癌細胞SW620， 能明顯下調其FAK的表達， 從而有效抑制SW620的侵襲及轉移能力， 為后續的實驗打下基礎。

參考文獻

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[8]Sonoda Y， Hada N， Kaneda T， et al. A synthetic glycosphingolipid-induced antiproliferative effect in melanoma cells is associated with suppression of FAK， Akt， and Erk activation. Biol Pharm Bull， 2008， 31（6）：1279-1283.

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[10]Hauck CR， Sie DJ， Hsia DA， et al. Inhibition of focal adhesion kinase expression or activity disrupts epidermal growth factor stimulated signaling promoting the migration of invasive hunman carcinoma cells. Cancer Res， 2001， 61（19）：7079-7090.

[11]Su GQ， Zhang FX， Mao HH， et al. Research of shRNAmir inhibitory effects towards focal adhesion kinase expression in the treatment of gastric cancer. Oncol Lett ， 2015， 9（2）：595-603.

[12]Egawa H. Jingushi K， Hirono T. et al. The miR-130 family promotes cell migration and invasion in bladder cancer through FAK and Akt phosphorylation by regulating PTEN. Sci Rep， 2016（6）：20574.

[收稿日期：2016-02-01]