補腎安胎沖劑對復發性自然流產小鼠蛻膜血管內皮生長因子及其受體調控作用研究

儲繼軍，李偉莉，吳獻群，秦秀娟

(1.湖北中醫藥大學中醫臨床學院，湖北 武漢　430061；2. 安徽中醫藥大學第一附屬醫院婦科，安徽 合肥　230031；3. 湖北中醫藥大學附屬醫院婦產科，湖北 武漢　430061；4.安徽中醫藥大學研究生部，安徽 合肥　230038)

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補腎安胎沖劑對復發性自然流產小鼠蛻膜血管內皮生長因子及其受體調控作用研究

儲繼軍1,2，李偉莉2，吳獻群3，秦秀娟4

(1.湖北中醫藥大學中醫臨床學院，湖北 武漢430061；2. 安徽中醫藥大學第一附屬醫院婦科，安徽 合肥230031；3. 湖北中醫藥大學附屬醫院婦產科，湖北 武漢430061；4.安徽中醫藥大學研究生部，安徽 合肥230038)

[摘要]目的觀察補腎安胎沖劑對復發性自然流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)小鼠胚胎丟失率和蛻膜組織血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體的影響。方法采用Clark經典RSA小鼠模型，將RSA小鼠隨機分為模型組、補腎安胎沖劑低劑量(11.7 g/kg)組、補腎安胎沖劑高劑量(23.4 g/kg)組，黃體酮膠囊(156 mg/kg)組，另取正常妊娠小鼠作為正常組，每組8只。末次給藥后，處死小鼠，計算胚胎丟失率；光鏡下觀察蛻膜組織血管形態學改變；采用免疫組化法檢測蛻膜組織VEGF、血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)、可溶性血管內皮生長因子受體-1(soluble vascular endothelial growth factor receptor 1，sVEGFR-1)的表達；采用RT-PCR法檢測小鼠蛻膜組織中VEGF、VEGFR-2及sVEGFR-1 mRNA的表達。結果補腎安胎沖劑能改善蛻膜組織血管形態學變化，升高蛻膜組織中VEGF和VEGFR-2蛋白含量，降低sVEGFR-1蛋白含量；能顯著降低RSA小鼠胚胎丟失率(P<0.05)，升高蛻膜組織中VEGF和VEGFR-2 mRNA表達水平，降低sVEGFR-1 mRNA表達水平(P<0.05)，呈現明顯的量效關系。結論補腎安胎沖劑對RSA小鼠具有一定的保護作用，其機制可能與調控VEGF及其受體，改善蛻膜組織血管重鑄有關。

[關鍵詞]復發性自然流產；補腎安胎沖劑；血管內皮細胞生長因子；血管重鑄

復發性自然流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)，中醫稱為滑胎，是妊娠期最常見的并發癥之一，其發生率約占育齡婦女的1%～2%，占所有妊娠丟失的15%～20%[1]。RSA發病原因復雜[2-3]，西醫療效尚待提高。補腎安胎沖劑是安徽中醫藥大學第一附屬醫院根據“腎主生殖”和“胞胎系于腎”理論，結合多年臨床實踐創制的特色中藥制劑，具有補腎健脾益氣安胎的作用，臨床療效確切[4-6]。本實驗通過復制RSA模型觀察補腎安胎沖劑對RSA小鼠的治療作用，并探討其可能機制。

1材料

1.1藥材與試劑補腎安胎沖劑(批號：皖藥制字BZ20080017)：由菟絲子、桑寄生、續斷、熟地黃、炒白術、白芍、黨參、炙黃芪、黃芩等組成，由安徽中醫藥大學第一附屬醫院制劑室提供；黃體酮膠囊(每粒50 mg，批號為國藥準字H20041902)：由浙江仙琚制藥股份有限公司提供；逆轉錄試劑盒(Revert Aid TM first Strand cDNA Synthesis Kit)(批號 00221108)：由Thermo公司提供；血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體(批號 E8562)：由Santa Cruz公司提供；血管內皮細胞生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)抗體(批號 4)：由Cell Signaling Technology提供；可溶性血管內皮生長因子受體-1(soluble vascular endothelial growth factor receptor 1，sVEGFR-1)抗體(批號 CJ36131)：由Bioworld公司提供。VEGF、VEGFR-2和sVEGFR-1檢測試劑盒均購于北京中杉公司。

1.2動物雌性CBA/J小鼠50只、雄性DBA/2小鼠20只及BALB/c小鼠5只，SPF級，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產許可證號：SCXK[京]2014-0004。

1.3儀器JB-P5 包埋機，由湖北省武漢俊杰電子有限公司提供；RM2016病理切片機，由上海萊卡儀器有限公司提供；PIKOREAL 96熒光定量PCR儀，由賽默飛世爾科技公司提供。

2方法

2.1RSA小鼠模型的復制按Clark經典RSA小鼠模型復制方法[7]，將雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2小鼠按2∶1合籠交配，復制RSA模型；將雌性CBA/J小鼠與雄性BALB/c小鼠按2∶1合籠交配，復制正常妊娠小鼠。檢出陰栓者計為妊娠第0天。

2.2分組及給藥將上述RSA模型小鼠隨機分為4組：模型組，補腎安胎沖劑低劑量(11.7 g/kg，相當于60 kg成人臨床劑量3倍)組，補腎安胎沖劑高劑量(23.4 g/kg)組，黃體酮膠囊(156 mg/kg)組，每組8只，另取正常妊娠小鼠8只作為正常組。于檢出陰栓第2天開始，除模型組及正常妊娠組小鼠接受同容積蒸餾水灌胃外，其余3組小鼠每天接受相應藥物灌胃(20 mL/kg)，每日1次，連續給藥15 d。

2.3檢測指標

2.3.1胚胎丟失率觀察末次給藥24 h后，處死小鼠，剖視子宮觀察胚胎丟失情況，具體判斷標準參考文獻[8]。正常胚胎粗大狀如串珠，宮內尚未發現痕血，胚胎呈現淡紅色；流產胚胎的宮內可見明顯痕血，胚胎顏色呈黑褐色，或子宮呈現竹節樣改變，胚胎出現完全或部分消失。胚胎丟失率=丟失胚胎數/(丟失胚胎數+存活胚胎數)。

2.3.2蛻膜組織血管形態學觀察取固定部位蛻膜組織，置于4%多聚甲醛液中固定、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，普通光學顯微鏡下觀察蛻膜組織血管形態學改變。

2.3.3免疫組化法檢測蛻膜組織VEGF、VEGFR-2、sVEGFR-1的分布及表達參照免疫組化檢測試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒的說明書進行操作，即石蠟切片(厚度2 μm)，脫蠟至水，抗原微波修復后，加一抗、二抗孵育，顯色、襯染、中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察蛻膜組織切片，以細胞漿或細胞核內的棕黃色粗顆粒或棕黃色細膩顆粒彌漫分布為陽性表達。

2.3.4RT-PCR檢測蛻膜組織VEGF、VEGFR-2、sVEGFR-1 mRNA的含量取小鼠蛻膜組織100 mg，采用TRIzol法抽提小鼠蛻膜組織中總RNA，總反應體系10 μL，合成cDNA。取逆轉錄產物1 μL作為反應模板，反應體系10 μL。VEGF引物序列：正向引物為5′- CTCTCTCCCAGATCGGTGAC-3′，反向引物為5′-CAAAGGAATGTGTGGTGGGG-3′；VEGFR-2引物序列：正向引物為5′- ACAGTTCCCAGAGTGGTTGG-3′，反向引物為5′-GTCACTGACAGAGGCGTAGA-3′；sVEGFR-1引物序列：正向引物為5′- CAGACAATTCTGCAGCACCT-3′,反向引物為5′-TCCTTCGAGGTGGATTTAGG-3′；β-actin引物序列：正向引物為5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，反向引物為5′- TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。擴增條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸10 s，40個循環，反應結束后，由電腦軟件自動分析讀取CT值，使用相對定量研究方法進行分析。

3 結果

3.1補腎安胎沖劑對RSA小鼠胚胎丟失率的影響模型組小鼠胚胎丟失率較正常組顯著升高(P<0.05)；模型組和補腎安胎沖劑高、低劑量組小鼠胚胎丟失率比較，差異具有統計學意義(F(2，21)=55.32，P=0.000)，提示補腎安胎沖劑在降低RSA小鼠胚胎丟失率方面具有明顯的量效關系，以補腎安胎沖劑高劑量的效應最為顯著；黃體酮膠囊組和補腎安胎沖劑高、低劑量組小鼠胚胎丟失率比較，差異具有統計學意義(F(2，21)=16.04，P=0.000)，黃體酮膠囊降低RSA小鼠胚胎丟失率的效應與補腎安胎沖劑高劑量組相當。見表1。

表1　各組小鼠胚胎丟失率比較±s)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與補腎安胎沖劑低劑量組比較，△P<0.05。

3.2補腎安胎沖劑對RSA小鼠蛻膜組織血管形態學影響與正常妊娠小鼠比較，模型組RSA小鼠絨毛大小不一，形態不規則，合體滋養層細胞及細胞滋養層細胞均明顯減少，萎縮變性，排列紊亂，可見凋亡細胞及炎性細胞，核固縮，染色較深，間充質及基質見纖維素樣變性，間質血管減少；蛻膜組織變性，上皮不完整，細胞排列不規則，腺體皺縮，血管瘀血。給予補腎安胎沖劑和黃體酮膠囊干預后，RSA小鼠蛻膜組織血管形態學呈現好轉趨勢。結果見圖1。

注:A.正常組;B.模型組;C.補腎安胎沖劑低劑量組;D.補腎安胎沖劑高劑量組;E.黃體酮膠囊組;白色箭頭示蛻膜組織血管。

圖1各組小鼠蛻膜組織形態學變化(HE染色，10×20倍)

3.3補腎安胎沖劑對RSA小鼠蛻膜組織中VEGF、VEGFR-2、sVEGFR-1分布及表達的影響在各組小鼠蛻膜中，VEGF主要表達于蛻膜細胞、腺上皮細胞和血管內皮細胞胞漿中，細胞核未見明顯著色，蛻膜細胞陽性染色強，見圖2；VEGFR-2在蛻膜組織的陽性表達位于大部分蛻膜細胞及少數腺上皮細胞的胞核和胞漿內，見圖3；sVEGFR-1在血管內皮細胞中存在豐富的表達，見圖4。模型組RSA小鼠VEGF、VEGFR-2的表達低于正常組，補腎安胎沖劑低、高劑量組及黃體酮膠囊組，而sVEGFR-1的表達高于正常組，補腎安胎沖劑低、高劑量組及黃體酮膠囊組。

3.4補腎安胎沖劑對RSA小鼠蛻膜組織中VEGF、VEGFR-2、sVEGFR-1 mRNA表達的影響與正常妊娠小鼠比較，模型組小鼠蛻膜組織中VEGF mRNA和VEGFR-2 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，sVEGFR-1 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。模型組和補腎安胎沖劑高、低劑量組小鼠蛻膜組織中VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA和sVEGFR-1 mRNA表達水平比較，差異均具有統計學意義(VEGF mRNA：F(2，15)=85.56，P=0.000；VEGFR-2 mRNA：F(2，15)=68.35，P=0.000；sVEGFR-1 mRNA：F(2，15)=9.33，P=0.002)，以補腎安胎沖劑高劑量升高VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA表達水平和降低sVEGFR-1 mRNA表達水平的效應最顯著。黃體酮膠囊組和補腎安胎沖劑高、低劑量組小鼠蛻膜組織中VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA和sVEGFR-1 mRNA表達水平比較，差異均具有統計學意義(VEGF mRNA：F(2，15)=11.21，P=0.001；VEGFR-2 mRNA：F(2，15)=14.83，P=0.000；sVEGFR-1 mRNA：F(2，15)=18.71，P=0.000)，以黃體酮膠囊升高VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA表達水平和降低sVEGFR-1 mRNA表達水平的效應最顯著。見圖5。

注:A.正常組;B.模型組;C.補腎安胎沖劑低劑量組;D.補腎安胎沖劑高劑量組;E.黃體酮膠囊組;白色箭頭示棕黃色的VEGF蛋白。

圖2　各組小鼠VEGF的表達情況(10×20倍)

圖3各組小鼠VEGFR-2的表達情況(10×20倍)

4討論

RSA屬中醫學“滑胎”范疇。腎氣不足致胎失所系，脾虛血少致胎失所養等，均可導致胎元不固而殞墮[9]。補腎安胎沖劑是安徽中醫藥大學第一附屬醫院根據“腎主生殖”“胞胎系于腎”理論，經過多年臨床驗證形成的中藥制劑，具有補腎健脾、益氣安胎的功效[10]。方中菟絲子補腎益精為全方主藥；續斷既補肝腎，又具止血安胎之功效；桑寄生有補肝腎、養血安胎之功；熟地黃滋陰補腎、益精養血；黨參、黃芪補脾益腎，即能補脾腎之氣，又兼固精之效；黃芩清熱止血安胎，與白術配伍使用，有朱丹溪“安胎圣藥”之妙。全方緊緊圍繞滑胎“腎脾虧虛”的核心病機，補腎以養先天，使腎系有力、胎元得固；健脾以益后天，使氣血生化有源、胎元得養。

注:A.正常組;B.模型組;C.補腎安胎沖劑低劑量組;D.補腎安胎沖劑高劑量組;E.黃體酮膠囊組;白色箭頭示棕黃色的sVEGFR-1蛋白。

圖4各組小鼠sVEGFR-1的表達情況(10×20倍)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與補腎安胎沖劑低劑量組比較，△P<0.05；與補腎安胎沖劑高劑量組比較，◇P<0.05。

圖5各組小鼠VEGF、VEGFR-2和sVEGFR-1 mRNA

在妊娠過程中，胎盤微血管的生成及胎盤血管網絡的構建是至關重要的[11]，血管建立在胎盤與子宮內膜之間，并侵入蛻膜組織，血管新生及其通透性改變在胚胎著床到胎盤形成中發揮著重要作用[9]。VEGF是一種主要的血管生成和血管通透性誘導因子[12]，既有促進微小靜脈通透性增加，促進血管內皮細胞分裂和增殖，使細胞鈣聚集等作用，又可誘導血管生成，參與母胎界面血管重鑄[13]。妊娠時期原始血管形成，主要來源于內皮細胞的VEGF通過與其特異性受體VEGFR-2結合而促進細胞侵襲蛻膜組織，完成血管重鑄過程[14]。VEGFR-2具有很強的酪氨酸激酶活性，介導了VEGF的主要作用。本實驗結果表明，模型組RSA小鼠VEGF和VEGFR-2的表達較正常妊娠小鼠顯著降低，與文獻報道[15]一致。與模型組RSA小鼠比較，補腎安胎沖劑低、高劑量組及黃體酮膠囊組均可不同程度增加小鼠蛻膜組織中VEGF和VEGFR-2的表達，并且明顯減少小鼠的胚胎丟失率。

sVEGFR-1是VEGFR-1的可溶性形式，能與膜表面受體競爭結合VEGF，起著天然的內源性血管生成抑制劑作用，阻斷VEGF促血管生成的信號轉導通路，從而抑制VEGF誘導血管生成的生物學活性[16]。Ahmad等[17]也觀察到來自正常妊娠絨毛的條件培養液促進內皮細胞遷移、管狀形成，加入外源性sVEGFR-1則削弱其作用，導致流產的發生。本實驗結果顯示，模型組RSA小鼠sVEGFR-1的表達較正常妊娠小鼠明顯升高，補腎安胎沖劑低、高劑量組可不同程度降低小鼠蛻膜組織中sVEGFR-1的表達。

綜上所述，補腎安胎沖劑對RSA小鼠蛻膜組織中血管生成具有一定的促進作用，其機制可能是通過升高RSA小鼠蛻膜組織中VEGF和VEGFR-2的含量，降低sVEGFR-1的含量，從而促進小鼠蛻膜組織中血管生成，保護妊娠。

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Regulatory Effect of Granule for Tonifying the Kidney and Preventing Miscarriage on Decidual Vascular Endothelial Growth Factor and Its Receptor in Mice with Recurrent Spontaneous Abortion

CHUJi-jun1,2,LIWei-li2,WUXian-qun3,QINXiu-juan4

(1.CollegeofClinicalChineseMedicine,HubeiUniversityofChineseMedicine,HubeiWuhan430061,China; 2.DepartmentofGynecology,TheFirstHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031;3.DepartmentofObstetricsandGynecology,TheAffiliatedHospitalofHubeiUniversityofChineseMedicine,HubeiWuhan430061;4.GraduateDivision,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of Granules for Tonifying the Kidney and Preventing Miscarriage(GTKPM)on embryo loss rate and decidual vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor in mice with recurrent spontaneous abortion (RSA). MethodsThe classical Clark RSA mice were selected and randomly divided into model group, low-dose GTKPM group (11.7 g/kg), high-dose GTKPM group (23.4 g/kg), and progesterone capsule group (156 mg/kg), each with 8 mice. Another 8 normal pregnancy mice were selected as the control group. After the last administration, the mice were sacrificed, and the embryo loss rate (ELR) was calculated. The changes in the vascular morphology of decidual tissue were observed under a light microscope. The protein expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2), and soluble vascular endothelial growth factor receptor 1 (sVEGFR-1) in decidual tissue was measured by immunohistochemistry. Moreover, RT-PCR was performed to measure the mRNA expression of VEGF, VEGFR-2, and sVEGFR-1 in decidual tissue. ResultsGTKPM improved the vascular morphology of decidual tissue, increased the protein expression of VEGF and VEGFR-2 in decidual tissue, and reduced the protein expression of sVEGFR-1. In addition, GTKPM significantly reduced the ELR of RSA mice (P<0.05), increased the mRNA expression of VEGF and VEGFR-2 in decidual tissue, and reduced the mRNA expression of sVEGFR-1 (P<0.05),with a significant dose-effect relationship. ConclusionGTKPM has a certain protective effect on RSA mice, which may be related to its regulatory effect on VEGF and its receptor and improving the vascular remodeling of decidual tissue.

[Key words]Recurrent spontaneous abortion; Granule for Tonifying the Kidney and Preventing Miscarriage; Vascular endothelial growth factor; Vascular remodeling

(收稿日期：2016-01-20；編輯：姚實林)

[中圖分類號]R285.5；R714.21[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.02.023

通信作者：吳獻群，foursides@163.com

作者簡介：儲繼軍(1977-)，男，博士研究生，主治醫師