紅細胞包載丹參酮ⅡA磺酸鈉的制備及其性能考察

●董曉婷 牛亞偉 王悅敏 趙嘉蘭 秦凌浩

紅細胞包載丹參酮ⅡA磺酸鈉的制備及其性能考察

●董曉婷 牛亞偉 王悅敏 趙嘉蘭 秦凌浩

目的：制備載藥紅細胞（STS-RBCs），并對其載藥參數和生物學特性進行考察。方法：采用低滲預膨脹-等滲重封閉法制備STS-RBCs。采用高效液相色譜法測定其載藥量。通過單因素考察法，篩選出載藥最佳條件。通過考察STS-RBCs的離心穩定性，湍流穩定性，儲存穩定性，光照穩定性以及體外溶血情況對其穩定性和安全性進行考察。采用顯微鏡觀察STS-RBCs和正常紅細胞的形態。采用透析法，對載藥紅細胞體外釋放進行考察。結果：選擇62%×PBS（pH7.4）作為預膨脹工作液。最佳載藥量為67.05±6.94%。在37℃，STS濃度（溶劑為62%×PBS）1mg/ml，藥物與壓積紅細胞體積比2：1時，載藥量最高。STS-RBCs在3000rpm以下時，離心穩定性良好，湍流穩定性好，體外溶血實驗合格，RBCs作為藥物載體對STS有光照保護作用。在4℃保存情況下，5天內穩定。體外釋放可持續48h以上，且無突釋現象。結論：紅細胞可以作為STS的載體。

紅細胞；丹參酮ⅡA磺酸鈉；載藥量；體外釋放；體內釋放

丹參酮ⅡA磺酸鈉（STS）是丹參酮ⅡA的磺酸化產物。大量實驗證明，STS具有保護心肌細胞免受氧化應激損傷的作用，以及降低心肌梗死大小的優點[1]。此外，幾項研究表明STS具有抗炎的優點，減少了急性心肌梗死誘導的左心室重塑，促進血管生成[2]。然而，STS的半衰期較短，近年來紅細胞作為藥物載體的研究頗為豐富，因此本實驗采用紅細胞作為STS的載體，并對其進行一系列性質研究。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

FA1104N分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；PHS-3C酸度計（上海儀電科技儀器股份有限公司）；Hitachi Chromaster系列高效液相色譜儀（5110四元泵，5310柱溫箱，5410紫外檢測器，5210自動進樣器，日本日立高新技術公司）；T6型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；顯微鏡（Carl Zeiss,德國）

1.2 試劑

丹參酮IIA磺酸鈉原料藥（西安昊軒生物科技有限公司）；肝素鈉注射液（常州千紅生化制藥股份有限公司）；紅細胞裂解液，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT），（上海碧云天生物技術有限公司）；甲醇，乙腈（J.T.Barker，色譜純）；二甲基亞砜（DMSO），磷酸二氫鈉，磷酸（廣州化學試劑廠，分析純）1×PBS，10×PBS，HyClone；

2 方法與結果

2.1 HPLC方法測定STS含量

采用HPLC法進行相關的含量測定。色譜條件：C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm），以磷酸鹽緩沖液（pH3.5）—乙腈（40∶60）為流動相，流速為1.0mL/min，檢測波長為271nm，柱溫40℃，進樣量為20μl。

取20μl STS-RBCs，加入980μl紅細胞裂解液于4℃振搖孵育15min，充分裂解后混勻，取20ul裂解液，加入3980ul甲醇，渦旋3min，10000rpm離心10min，取上清，HPLC分析其STS含量。

2.2 壓積紅細胞的提取分離

SD大鼠眼靜脈叢取血，將新鮮血液置于經肝素鈉潤濕的離心管中，2000rpm離心10min，棄上清和白細胞層。4倍體積PBS（pH7.4）洗滌三次，棄上清得壓積紅細胞。取1體積壓積紅細胞與4體積不同梯度濃度的PBS低滲液混勻，4℃振搖孵育15min，2000rpm離心10min，取可見溶血前一濃度溶液作為低滲預膨脹工作液。

2.3 STS-RBCs的制備

取0.5ml壓積紅細胞，加入2ml預膨脹工作液于37℃下不斷振搖孵育15min后，2000rpm離心10min，定量棄去1.5ml上清。加入1ml濃度為1mg/ml的丹參酮IIA磺酸鈉低滲預膨脹工作液溶液，37℃下不斷振搖孵育1h。加入42μl濃縮液于37℃下不斷振搖孵育1h，使其恢復等滲條件。2000rpm離心10min，定量吸取1.2ml上清，加入3.2mlPBS，充分混勻后，2000rpm離心10min。重復操作三次，充分棄去游離STS。其中預膨脹工作液的選擇通過篩選50%，52%，54%，56%，58%，60%，62%，64%， 66%，68%作為預膨脹溶液，發現紅細胞在62%×PBS中不發生可見溶血，在60%×PBS中發生可見溶血，因此選擇62%×PBS為預膨脹工作液。

10×PBS濃縮液加入體積根據以下公式計算。

V：10×PBS濃縮液加入體積 V1：預膨脹液體積 C1：等滲液濃度

C2：低滲液濃度 C3：濃縮液濃度

最佳載藥條件考察：

采用單因素設計方法，考察在不同載藥溫度（4℃，25℃，37℃），載藥濃度（0.2-1.0mg/mL），RBC和STS體積比（2∶1,1∶1,1∶2,1∶3,1∶4）條件下紅細胞的載藥量。結果如圖圖1-A所示，預膨脹紅細胞與STS在37℃孵育，紅細胞的載藥量可達到68.86±1.62%，明顯高于4℃（44.46±2.60%）和25℃（62.56±0.49%）；載藥濃度考察表明在0.2-1.0mg/ml范圍內，紅細胞的載藥量隨著STS濃度的增大而增大，因此選擇本實驗STS載藥濃度為1.0 mg/ml，如圖1-B；考察STS和RBCs體積比是發現載藥量隨著紅細胞體積的減少而下降，當STS與紅細胞體積比為2：1時，其對STS的載藥量達到最大，結果見圖1-C。

圖1 STS-RBC制備條件的優化：溫度（4,25,37℃）對包封率的影響（A）；STS濃度（0.2-1.0mg/ml）對STS-RBC包封率的影響（B）；載藥體積比對STS-RBCs包封率的影響（C）。Figure 1. Optimization of drug loading conditions∶ effect of temperature on encapsulation efficiency of STS-RBCs (4, 25, 37℃) (A); effect of STS concentration on the entrapment efficiency of STS-RBCs (0.2-1.0mg/ml) (B); effect of drug loading volume ratio on entrapment efficiency of STS-RBCs (VSTS∶VRBCs=1∶3, 1∶2, 1∶1, 2∶1, 3∶1) (C).

2.4 STS-RBCs載藥前后形態觀察

正常紅細胞的形態像一個中間凹和邊緣厚的圓盤，如圖2-A所示。在用62%×PBS孵育RBCs后，紅細胞腫脹并變大，表面空隙打開，如圖2-B所示。用10×PBS孵育RBCs后，RBCs恢復正常大小，表面孔閉合，如圖2-C所示。

圖2 正常紅細胞的形態（A），預膨脹后紅細胞的形態（B），載藥后STS-RBC的形態（C）Figure 2. The morphology of normal RBCs (A), per-expansion RBCs (B) and STS-RBCs (C)

圖3 在不同轉速下（1000-6000 rpm），STS-RBCs的離心穩定性（A）；通過控制STS-RBC通過4.5號注射器針頭的次數，考察湍流穩定性（B）；在5000Lux光強度下的光照穩定性（C）Figure 3.The stability of STS-RBCs under different centrifugal forces (1000-6000rpm) (A); the turbulence stability of the STS-RBCs was evaluated by the number of injections of the 4.5 injector (B); the stability of STS and STS-RBCs at different time points under 5000Lux light intensity (C).

2.5 STS-RBCs穩定性考察

2.5.1 離心穩定性

取0.5ml STS-RBCs，加入PBS溶液2ml混勻后，分別于1000-6000rpm條件下離心10min，取上清，按2.1項下方法，測定上清液中STS的含量。結果表明，隨著離心轉速的增大，STS-RBCs穩定性下降，當轉速達到3000rpm時，STS的滲漏量為0.121±0.005mg，明顯高于2000rpm時的0.044±0.006mg，結果見圖3-A。

2.5.2 湍流穩定性

按2.3法制備STS-RBCs懸液，取1mLSTS-RBCs懸液，使其通過4.5號注射器針頭，通過控制其通過注射器針頭的次數（5，10，15，20，25次），然后分別在2000rpm條件下離心10min，取上清，按2.1項下方法，對STS進行含量測定。結果表明，載藥紅細胞湍流穩定性較好，在通過4.5號注射器針頭20次時，其STS滲漏量僅0.123±0.007%，當沖擊次數增加至25次時，STS滲漏量僅為0.278±0.006%，表明隨著沖擊次數的增加，STS-RBCs的穩定性雖然逐漸下降，但仍有較高的穩定性，結果見圖3-B。

2.5.3 光照穩定性將STS-RBCs和相應濃度的STS分別置于恒溫恒濕光照培養箱中培養96小時，光強5000Lux，溫度25℃。分別于0，6，12，24，36，60，96小時取樣，并按照2.1項下方法測定其中STS濃度。結果表明，在光照強度為5000Lux條件下，STS-RBCs組的穩定性明顯優于STS組，具體表現在照射6小時后，STS組的藥物含量降低至85.92±0.28%，而STS-RBCs組僅降至99.25±0.81%; 96小時后，STS組減少至初始劑量的52.85±0.68%而STSRBCs組為65.59±0.61%。因此將RBCs用做STS的載體能夠降低其光降解，結果見圖3-C。

2.5.4 溶血實驗

配制2%紅細胞懸浮液，配制2%紅細胞全溶血。取2mL載藥紅細胞與2mL2%紅細胞懸浮液混勻（溶液1），取2mL壓積紅細胞與2ml2%紅細胞懸浮液混勻（溶液2），取2mL壓積紅細胞與2mLPBS（溶液3）取4mL 2%紅細胞全溶血（溶液4），將溶液1，2，3分別于37℃振搖下孵育15min，離心，取上清，紫外分光光度法對其在540nm處吸光度進行測定。溶血率（%）=（A溶液1-A溶液2-A溶液3）/A溶液4×100%，溶血率為0.22%，小于5%，體外溶血實驗合格，結果見表1。

2.6 體外釋放考察

取4ml載藥紅細胞和相同藥量的丹參酮IIA磺酸鈉于透析袋內，釋放介質為1000ml PBS，介質溫度37℃，分別于0.5，1，2，3，4，6，8，10，12，16，20，24，28，32，36，40，44，48h取樣，HPLC法測定STS釋放量。繪制藥物釋放曲線。結果如圖5所示，將RBCs作為STS的載體之后，其相對于游離藥來講明顯釋放緩慢。游離藥在6小時是釋放已經接近100%，而STS-RBCs在6小時時僅釋放了6.76%±0.74%。STSRBCs在48小時之后還在持續緩慢釋放，具有明顯的緩慢釋放效果。

表1 溶血實驗結果Table1.Hemolysis test results

Figure 5 In-vitro release profile of STS-RBCs and STS in PBS solution at 37°C

3 討論

考察紅細胞載藥濃度時，對STS的濃度考察最大為1mg/ml，是由于STS在62%×PBS中溶解度有限。且在加入10×PBS濃縮液時，當STS濃度高于1mg/ml時，會有STS結晶析出。

對STS-RBC載藥量考察時，選用紅細胞裂解液進行裂解，對紅細胞裂解液進行HPLC分析，表明其不會對STS主峰產生干擾。

目前已有大量研究采用紅細胞膜載藥，通過擠出法控制載藥紅細胞膜粒徑為納米級別[3-5]，極大的提高了其穩定性。且通過擠出法控制其粒徑為100-200nm，可有效逃避巨噬細胞攝取，使藥效得到更長久的發揮。但是紅細胞膜載藥破壞了紅細胞結構的完整性，其在生物相容性和生物降解性方面的特性需進一步考察。且紅細胞膜載藥對載藥量有很大限制。目前有很多研究采用脂質插入法對載藥紅細胞膜納米球進行修飾，將其靶向至特定部位[16]。如何將紅細胞載藥和紅細胞膜載藥的優點相結合，研制出穩定性好，載藥量高，保留紅細胞結構完整性，并具有有效靶向特性的載體，是我們繼續努力的目標。

（作者單位：廣東藥科大學藥學院藥劑系）

[1] Chen X, Zhou Z W, Xue C C, et al. Role of P-glycoprotein in restricting the brain penetration of tanshinone IIA, a major active constituent from the root of Bunge, across the blood–brain barrier[J]. Xenobiotica, 2007, 37(6):635-678.

[2] Wei B, Li W W, Ji J, et al. The cardioprotective effect of sodium tanshinone IIA sulfonate and the optimizing of therapeutic time window in myocardial ischemia/reperfusion injury in rats [J]. Atherosclerosis, 2014, 235(2):318-327.

[3] Hu C M J, Zhang L, Aryal S, et al. Erythrocyte membranecamouflaged polymeric nanoparticles as a biomimetic delivery platform[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(27):10980-5. [16] Wang Q, Cheng H, Peng H, et al. Non-genetic engineering of cells for drug delivery and cell-based therapy.[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2015, 91:125–140.

[4] Lejeune A, Moorjani M, Gicquaud C, et al. Nanoerythrosome, a new derivative of erythrocyte ghost: preparation and antineoplastic potential as drug carrier for daunorubicin.[J]. Anticancer Research, 1994, 14(3A):915-9.

[5] Guo Y, Wang D, Song Q, et al. Erythrocyte Membrane-Enveloped Polymeric Nanoparticles as Nanovaccine for Induction of Antitumor Immunity against Melanoma.[J]. Acs Nano, 2015, 9(7):6918-33.

[6] Fu Q, Lv P, Chen Z, et al. Programmed co-delivery of paclitaxel and doxorubicin boosted by camouflaging with erythrocyte membrane. [J]. Nanoscale, 2015, 7(9):4020-30.

秦凌浩

董曉婷（1989～），女，2014級碩士研究生；通信作者：秦凌浩（1980～），男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向為藥物新技術。

廣東省自然科學基金項目（2014A030310362）；廣州市科技計劃項目（201508010036）；廣州市產學研協同創新重大專項項目（特色藥用脂質新產品的研究、開發及產業化，201605131249066）