探討激活Notch信號通路對人牙髓細胞增殖與分化的作用

管海潔

【摘要】 目的 探討激活Notch信號通路對人牙髓細胞增殖與分化的作用。方法 選取完整拔除的健康前磨牙與第三磨牙， 應用酶消化法進行原代培養與傳代培養。觀察培養結果。結果 第4代B組人牙髓細胞中的Notch信號通路的下游基因Hesl表達量低于C組（P<0.05）；第8代， B組人牙髓細胞中的Hesl表達量與C組比較， 差異有統計學意義（P<0.05）；第10代， B組人牙髓細胞中的Hesl表達量與C組比較， 差異有統計學意義（P<0.05）。結論 Notch信號通路是進化過程中的信號轉導機制， 能夠細胞間作用對其命運進行控制， 牙髓細胞存在較高的增殖以及多向分化的成體干細胞， 在組織中起到非常重要的作用。

【關鍵詞】 人牙髓細胞； Notch信號通路；增殖分化

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.15.210

Notch屬于穿膜受體， 其在人身體的各種器官與組織中均存在一定的涉及， 能夠借助介導細胞中的局部信號進行傳遞與級聯反應， 將鄰近細胞的分析差異進行固化或者擴大， 并對細胞的凋亡、分化以及增殖功能進行有效的調控[1]。近幾年來， Notch信號通路是多領域進行研究的熱點問題， 伴隨牙髓干細胞發現， 目前Notch信號通路是進行調控研究的重點內容。牙髓干細胞在牙源性腫瘤發病機制、牙齒組織再生與牙損傷修復中均存在一定關聯， 因此掌握調控牙髓干細胞的分子機制很有必要。現將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料及試劑 胎牛血清、青霉素10000 U/ml， 高糖型DMEM培養基、膠原酶、200 mmol/L L-谷氨酰胺、0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）、二甲基亞砜、5-二苯基四氮唑溴鹽、焦炭酸二乙酯。

1. 2 分組與培養 牙髓細胞主要來源：因阻生原因所拔除左下第三、左上第三磨牙；因正畸減數原因所拔除的右下第一前磨牙。將同一顆牙齒來源的牙髓細胞分為三組：A組：使用正常培養基對人牙髓細胞進行體外傳代培養；B組：在正常培養基中加入r-分泌酶抑制劑DAPY， 最終濃度為5 μmol/L；C組：在正常培養基與B組培養基中同步添加等量的r-分泌酶抑制劑DAPT溶劑二甲基亞砜（DMSO）。

1. 3 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

第4代B組人牙髓細胞中的Notch信號通路的下游基因Hesl表達量為（49.03±16.47）×10-2低于C組的（22.08±15.64）×10-2， 比值為0.30（t=37.538， P=0.001<0.05）；第8代， B組人牙髓細胞中的Hesl表達量為（57.23±16.46）×10-2 C組為（16.25±12.44）×10-2比值為0.22 （t=29.125， P=0.001<0.05）；第10代， B組人牙髓細胞中的Hesl表達量為（58.46±15.32）×10-2C組為（14.36±14.26）×10-2比值為0.20（t=33.143， P=0.001<0.05）。

3 討論

Notch的主要組成部分為Notch受體、Notch配體與轉錄因子（CSL）， 目前人體中發現了4種Notch受體， Notch受體是胞外亞基與跨膜亞基借助鈣離子所依賴的共價鍵形成的源二聚體。跨膜亞基包含RAM23結構域、跨膜區、一個核定位序列、一組蛋白重復序列， Notch通過其RAM23結構域與錨蛋白的重復序列， 能夠與DNA結合蛋白CSL進行結合[2]。目前在人類中發現的Notch配體共有5種， Notch配體也稱之為DSL蛋白， 單跨膜蛋白是與受體相似的物質， 胞外區中存在表皮生長因子樣的串聯重復序列以及DSL結構域[3]， 其中DSL結構是與Motch受體結合不可缺失的功能結構域， 其胞內區尚未確定。

相鄰細胞中的Notch受體與Notch配體完成結合后， 蛋白酶會對Notch受體進行切割， 將具有核定位信號的胞內結構域釋放， 所釋放出的胞內結構域進入細胞核， 與CSL結合， 并通過應答調控基因表。Notch受體與細胞配體Delta-Jagged結合， 解離Notch受體中兩個亞基， 將蛋白酶激活并對其實施雙重剪切， 將NICD區域（具有核定位信號）釋放， NICD到達細胞核后會CSL結合， 形成復合產物， 另一方面CSL能夠讓其他分子形成調節復合物， 實現對下游靶基因的表達進行調控。

3. 1 牙齒發育過程中所發揮的作用 Notch信號在牙齒的產生、再生方面具有重要作用， 有文獻[4]曾經指出上皮間質相互作用會對Notch基因表達進行調控， 與成牙本質細胞的分化以及成釉細胞分化存在關聯， 牙齒形成階段， 在口腔的上皮中Detal 表達較弱， 但細胞分化階段， 其在成牙本質細胞與成釉細胞中的表達逐漸增加， 且表達模式與鄰近的間質細胞Notch受體基因在表達方面互補， 除此之外Notch基因表達還存在區域特異性以及細胞類型特異性， 在間質與上皮緊密接觸區域不表達， 表明口腔上皮保持Notch下調需要間質源性信號。

3. 2 在DPSCs增殖、分化中的作用 Notch信號通過不同的受體與配體介導細胞之間的相互租用， 誘導方式包含各種信號誘導以及分化。在相同細胞中， 部分細胞會在較弱的Notch信號刺激下， 定向分化， 將信號在短時間內向鄰近細胞傳遞[5]， 且讓另一方向保持未分化狀態， 稱之為側向抑制。

3. 3 牙髓損傷修復中的調控 在牙齒齲損、損傷的條件下， Notch信號讓DPSCs特性修復損傷組織激活。Notch受體在受傷后表達逐漸上升。受傷牙齒中Notch 1表達會與少數病變牙髓細胞相近， 但是Notch 2接近病變、遠離病變間充質細胞中均表達， Notch 3在部分血管結構中表達[6， 7]。以上這些數據充分證明在牙髓損傷修復中存在Notch信號。牙髓損傷后Notch 2的表達增加， Notch 1與Notch 3的表達也隨之增加， 這證明牙髓損傷后會將Notch信號激活， 成牙本質細胞與牙髓細胞分化有緊密聯系， 通過對DPSCs介導進行控制修復牙髓組織。

參考文獻

[1] 鄒曉英， 莊姮， 岳林， 等.抑制Notch信號通路對人牙髓細胞的生物學效應.中華口腔醫學雜志， 2014， 49（4）：210-215.

[2] 鄭瓊丹， 邢泉， 廖維立， 等. Notch信號通路參與BMP-6對人牙髓細胞增殖分化作用的研究.中華老年口腔醫學雜志， 2015（2）： 65-69.

[3] 劉路， 韋曦， 吳莉萍， 等. Notch信號通路在牙髓和牙周細胞礦化及組織損傷修復中的調控作用研究.口腔生物醫學， 2010， 1（4）：169-172， 185.

[4] LI Jing-hui， LIU Da-yong， ZHANG Fang-ming， et al. Human dental pulp stem cell is a promising autologous seed cell for bone tissue engineering.中華醫學雜志（英文版）， 2011， 124（23）：4022-4028.

[5] 劉鳳英， 許彥枝， 陳彥平， 等.中藥骨碎補對人牙髓、牙齦、牙周膜成纖維細胞體外增殖的實驗研究.臨床和實驗醫學雜志， 2014（24）：2012-2015.

[6] 聶鑫， 金巖， 張勇杰， 等. dNCPs、TGF-β1及聯合應用對人牙髓成纖維細胞增殖、ALP及礦化的影響. 實用口腔醫學雜志， 2004， 20（2）：178-181.

[7] 趙川江， 章錦才， 徐琛蓉， 等. 人釉原蛋白基因轉染對人牙齦成纖維細胞生物學活性的影響. 中山大學學報（醫學科學版）， 2006， 27（z2）：25-27.

[收稿日期：2016-01-07]