UPLC法快速測定梔子復方制劑中梔子苷和西紅花苷-1含量

彭小芳，郝　順，林　嚴，莫鎮濤，陳　陽，李文娜

(遵義醫學院珠海校區藥理教研室，珠海　519041)

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·藥物分析·

UPLC法快速測定梔子復方制劑中梔子苷和西紅花苷-1含量

彭小芳，郝順，林嚴，莫鎮濤，陳陽，李文娜*

(遵義醫學院珠海校區藥理教研室，珠海519041)

摘要：目的建立快速測定梔子復方制劑復方牛黃消炎膠囊、清胃黃連丸和龍澤熊膽膠囊中梔子苷和西紅花苷-1的方法。方法采用UPLC法。色譜柱為 BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：甲醇-水以不同梯度洗脫；流速：0.3 mL·min-1；檢測波長：0～7 min為238 nm，7～20 min為440 nm；柱溫：30 ℃；進樣量為2 μL。結果3種復方制劑中梔子苷在0.010～1.000 mg·mL-1范圍內呈良好的線性關系(r=0.999 9)，平均回收率分別為98.2%，99.9%和100.3%，RSD分別為1.3%，1.4%和1.0%；西紅花苷-1在0.1～10.0 μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系(r=0.999 9)。平均回收率分別為99.6%，97.4%和98.3%，RSD分別為1.3%，1.4%和1.5%。結論梔子苷和西紅花苷-1在20 min內獲得良好分離，該方法簡便、準確、快速，可用于梔子復方制劑中梔子苷和西紅花苷-1的測定。

關鍵詞：梔子苷；西紅花苷-1；梔子復方制劑；超高效液相色譜法

梔子來源于茜草科植物梔子的藥用果實，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效。梔子苷和西紅花苷是梔子的主要化學成分[1]。梔子苷具有抗炎、利膽等作用[2-3]；西紅花苷在抗炎、防治心血管疾病等方面具有明確的藥理作用[4-5]。龍澤熊膽膠囊(含有龍膽、地黃、梔子、黃連、大黃等17味中藥)有清熱散風、止痛退翳之功效；復方牛黃消炎膠囊(含有人工牛黃、梔子、珍珠母等11味中藥)具有清熱解毒、鎮靜安神的功效；清胃黃連丸(含有黃連、地黃、知母、梔子等14味中藥)具有清胃瀉火、解毒消腫之功效。《中國藥典》2010年版規定龍澤熊膽膠囊以龍膽苦苷為檢測標準；復方牛黃消炎膠囊和清胃黃連丸均以檢測鹽酸小檗堿為檢測標準[6]。梔子也是3種中成藥的重要組分之一，其有效成分(梔子苷和西紅花苷)的含量可直接影響藥物的藥效，現行藥典采用HPLC法測

定梔子苷的含量而未檢測西紅花苷的含量。因此，本文采用UPLC法同時測定3種中成藥中梔子苷和西紅花苷-1的含量，為補充、完善含有梔子苷和西紅花苷的中成藥質量控制標準提供依據。

1儀器與試藥

1.1儀器 超高效液相色譜儀(美國Waters公司，配有Waters Acquity UPLC BEH Shield RP C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱、四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower 3色譜工作站)。KQ3200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XS 205電子天平(METTLER TOLEDO儀器有限公司)。

1.2試藥 梔子苷對照品(西安開來生物工程有限公司，批號K130116)；西紅花苷-1(crocin-1)為本實驗室自制[7]。龍澤熊膽膠囊(吉林真元制藥有限公司，批號20130101)；復方牛黃消炎膠囊(云南白藥集團股份有限公司，批號WLE 12003)；清胃黃連丸 (山西華康藥業股份有限公司，批號20140301)。甲醇為色譜純(Merck)；水為蒸餾水；其余試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1溶液的制備2.1.1對照品溶液的制備精密稱取對照品梔子苷和西紅花苷-1適量，分別加體積分數為50%的甲醇配制成1.000 0 mg·mL-1的梔子苷和10.0 μg·mL-1的西紅花苷-1混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備成藥分別研碎，精密稱定0.1 g，置于10 mL量瓶中，加入體積分數為50%的甲醇溶液，超聲提取20 min，取出，定容至刻度。振搖均勻，取液層，以8 000 r·min-1離心10 min，上清液用0.22 μm的濾膜過濾后作為供試品溶液。

2.2色譜條件C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱。流動相為水(A)-甲醇(B)梯度洗脫(0～5 min，90%～82%A；5～13.3 min，82%～62%A；13.3～16.7 min，62%～50%A；16.7～19 min，50%～90%A)。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：0～7 min，238 nm；7～20 min，440 nm；進樣量：2 μL。對照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1UPLC圖

A.梔子苷、 西紅花甘-1混合對照品; B.復方牛黃消炎膠囊; C.清胃黃連丸; D.龍澤熊膽膠囊; 1.梔子苷;2.西紅花苷-1

Fig.1 UPLC chromatograms

A.the standard products of geniposide and crocin-1;B.Niuhuangxiaoyan Capsules;C.Qingweihuanglian Pills;D.Longzexiongdan Capsules; 1. geniposide;2. crocin-1

2.3方法學考察

2.3.1線性考察實驗取2.1.1項下的梔子苷和西紅花苷-1對照品混合液0.5，1，2，4和8 mL，置于10 mL量瓶中，加體積分數為50%的甲醇稀釋至刻度，精確吸取2 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以梔子苷質量濃度(mg·mL-1)和西紅花苷-1質量濃度(μg·mL-1)為橫坐標、記錄峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，經線性回歸，得梔子苷線性方程：Y=3 227.430 3X+2 307.3，r1=0.999 9；得西紅花苷-1線性方程：Y=73 813X+757，r2=0.999 9。表明梔子苷和西紅花苷-1分別在0.010～1.000 mg·mL-1和0.1～10.0 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.3.2精密度實驗精密吸取對照品混合溶液2 μL，按照2.2項下色譜條件，連續進樣6次，測定梔子苷和西紅花苷-1峰面積， RSD值分別為1.13%和1.01%，表明儀器精密度良好[8]。

2.3.3穩定性實驗按照2.2項下色譜條件，分別在0.5，1，3，6和12 h精密吸取同一批次供試品溶液，測定梔子苷和西紅花苷-1的峰面積，計算RSD分別為2.12%和1.76%。表明樣品溶液在12 h內穩定[9]。

2.3.4重復性實驗按照2.2項下色譜條件，精密吸取 2.1.2項下制備的供試液6份，分別測定記錄峰面積，梔子苷峰面積RSD為1.68%(n=6)；西紅花苷-1峰面積RSD為1.34%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.3.5加樣回收率實驗精密吸取已知含量的3種樣品液，分別加入一定量的梔子苷和西紅花苷-1對照品溶液，按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，按照2.2項下的色譜條件測定含量，平行測定6份，計算加樣回收率。梔子苷在復方牛黃消炎膠囊、清胃黃連丸、龍澤熊膽膠囊的平均回收率分別為98.2%，99.9%和100.3%，RSD均小于2%(n=6)，見表1；西紅花苷-1的平均回收率分別為99.6%，97.4%和98.3%，RSD均小于2% (n=6)，見表2。

表1梔子苷加樣回收率實驗結果

Tab.1 Results of recovery tests for geniposide

藥品稱樣量/g樣品中量/μg添加量/μg測出量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%復方牛黃消炎膠囊0.1172.1170.0330.196.598.21.30.1169.5170.0334.198.40.1171.3170.0331.797.20.1170.4170.0337.799.20.1169.6170.0339.399.90.1168.0170.0331.298.0清胃黃連丸0.1866.4867.01764.6101.899.91.40.1868.7867.01747.8100.70.1867.6867.01720.799.20.1865.3867.01742.7100.60.1867.1867.01718.599.10.1866.9867.01697.597.9龍澤熊膽膠囊0.1190.2191.0378.599.3100.31.00.1190.8191.0381.099.80.1191.2191.0385.3100.80.1190.1191.0386.1101.30.1191.9191.0379.599.10.1191.8191.0388.5101.5

表2西紅花苷-1加樣回收率實驗結果

Tab.2 Results of recovery tests for crocin-1

藥品稱樣量/g樣品中量/μg添加量/μg測出量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%復方牛黃消炎膠囊清胃黃連丸龍澤熊膽膠囊0.12.15.07.14100.699.61.30.12.35.07.31100.10.12.05.06.8898.10.12.45.07.3399.00.11.95.06.8098.60.12.55.07.61101.40.112.112.023.8098.997.41.40.112.212.023.7098.00.112.712.023.7096.00.112.612.024.3098.80.112.312.023.3095.90.112.512.023.7096.80.10.010.09.8899.998.31.50.10.010.09.9099.00.10.010.09.7597.10.10.010.09.8497.20.10.010.09.8299.80.10.010.09.7896.7

2.4含量測定

供試品的含量測定在2.2項色譜條件下，取2.1.2項下制備的供試品溶液3份進行分析，測定含量。復方牛黃消炎膠囊、清胃黃連丸和龍澤熊膽膠囊UPLC含量測定中，梔子苷平均含量分別為0.170%，0.867%和0.191%；復方牛黃消炎膠囊和清胃黃連丸中西紅花苷-1的平均含量分別為0.002 2%和0.012 4%；龍澤熊膽膠囊未檢出西紅花苷-1。結果見表3。

表3樣品測定結果

Tab.3 The content of geniposide and crocin-1 in different samples

(n=3)

3討論

梔子不同的炮制方法呈現出不同療效，藥用成分也相應地發生變化[10-13]。梔子苷是一種環烯醚萜葡萄糖苷[14]，具有抗炎、解熱、利膽和輕瀉作用，是抗炎和治療軟組織損傷的主要成分。現行標準對梔子藥材和含有梔子藥材的部分中藥復方采取測定梔子苷的含量作為質量標準，但都沒有西紅花苷-1含量測定的規定，而中成藥中梔子苷和西紅花苷-1含量的高低可能會對成藥的療效產生一定影響。復方牛黃消炎膠囊、清胃黃連丸和龍澤熊膽膠囊均對呼吸道炎癥具有良好的療效。西紅花苷也是梔子藥材的主要成分和發揮各種藥理活性的物質基礎，西紅花苷具有明顯的抗炎作用。Xu等[15]研究表明，西紅花苷對CXO-1、COX-2酶具有雙重抑制作用。能劑量依賴性抑制二甲苯誘導的小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠誘導的大鼠足趾腫脹，明顯抑制對吲哚美辛誘導的大鼠胃炎模型中的胃病病損的進展。藥理研究顯示，西紅花苷還具有保護心血管系統、抑制腫瘤細胞增殖、神經保護和保護肝臟等作用[16-18]。因此，本實驗同時測定了梔子中梔子苷和西紅花苷中含量最高的西紅花苷-1(含量約為梔子藥材中總西紅花苷的87%)的含量，有利于更全面反映含梔子復方制劑的內在品質。

本實驗建立了20 min內快速鑒定并測定3種含梔子復方制劑中西紅花苷-1和梔子苷的方法。方法學研究表明，本方法準確、簡便、快速，可作為梔子復方制劑中梔子苷和西紅花苷的含量測定方法。

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Simultaneous determination of crocin-1 and geniposide in Zhizi preparations by UPLC

PENG Xiaofang， HAO Shun， LIN Yan， MO Zhentao， CHEN Yang， LI Wenna*

(Department of Pharmacology， Zunyi Medical College， Zhuhai Campus， Zhuhai 519041， China)

Abstract:ObjectiveTo establish a fast method for simultaneous determination of geniposide and crocin-1 in three kinds of traditional Chinese medicines by UPLC. MethodsUPLC was adopted in this study. The analytical column was BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm) and gradient elution with methanol-H2O as mobile phase. The flow rate was 0.3 mL·min-1. The detection wavelength was set at 238 nm (0-7 min) for geniposide and 440 nm (7-20 min) for crocin-1. The column temperature was 30 ℃and the injection volume was 2 μL. ResultsThe two components had a good linear relationship between 0.010-1.000 mg·mL-1and 0.1-10.0 μg·mL-1. The average recoveries (n=6) of geniposide and crocin-1 in three preparations were 98.2%，99.9% and 100.3% (RSD 1.3%，1.4% and 1.0%) and 99.6%，97.4% and 98.3% (RSD 1.3%，1.4% and 1.5%)， respectively. ConclusionThe separation of geniposide and crocin-1 only needs 20 min with accuracy and good reliability. The method is simple，specific and suitable for the simultaneous determination of the content of geniposide and crocin-1 in the three preparations.

Key words:geniposide;crocin-1; Zhizi preparation; UPLC

(收稿日期：2015-06-23)

中圖分類號：R927.2

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)03-0245-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.007

*通信作者：李文娜，女，博士，碩士研究生導師

作者簡介：彭小芳，男，碩士研究生

基金項目：貴州省中藥現代化研究開發專項項目(編號：黔科合ZY字[2013]3018號)