利用斑馬魚(yú)模型評(píng)價(jià)氨基葡萄糖鹽酸鹽及淫羊藿的促進(jìn)骨骼礦化作用

張姍姍，何秋霞，韓建，王雪，侯海榮，李曉彬，張軒銘，韓利文，劉可春

(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

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【藥理與毒理】

利用斑馬魚(yú)模型評(píng)價(jià)氨基葡萄糖鹽酸鹽及淫羊藿的促進(jìn)骨骼礦化作用

張姍姍，何秋霞，韓建，王雪，侯海榮，李曉彬，張軒銘，韓利文*，劉可春*

(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

摘要：探討基于斑馬魚(yú)模型的不同濃度的氨基葡萄糖鹽酸鹽及淫羊藿提取物的促進(jìn)骨骼礦化活性。選用發(fā)育正常的72 hpf斑馬魚(yú)胚胎，以培養(yǎng)水為溶劑對(duì)照，各受試組分別加入不同濃度(1、10和100 μg/mL)的氨基葡萄糖鹽酸鹽溶液或淫羊藿提取物溶液，連續(xù)培養(yǎng)4 d后，用體積分?jǐn)?shù)為0.2 %鈣黃綠素染色1 h，在體式熒光顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)骨骼發(fā)育情況，拍照并用圖像分析軟件計(jì)算骨骼染色面積。與對(duì)照組相比，各受試組對(duì)斑馬魚(yú)骨骼礦化均呈現(xiàn)一定程度的促進(jìn)作用，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性。氨基葡萄糖鹽酸及淫羊藿提取物均具有較好的促進(jìn)斑馬魚(yú)骨骼礦化的活性。相同濃度條件下，氨基葡萄糖鹽酸鹽較淫羊藿提取物具有更好的促進(jìn)骨骼礦化活性。

關(guān)鍵詞：斑馬魚(yú)；氨基葡萄糖鹽酸鹽；淫羊藿提取物；骨骼礦化

骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少，骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性增加，并易于發(fā)生骨折的全身性骨骼疾病[1]。骨骼礦物質(zhì)密度(骨密度)是診斷骨質(zhì)疏松的最直接、最明確的判定依據(jù)，低骨密度是骨質(zhì)疏松性骨折的主要危險(xiǎn)因子[1-2]。所以提高骨骼的礦化程度，對(duì)于預(yù)防和緩解骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生具有重要的意義。臨床上，常采取補(bǔ)充流失骨質(zhì)或者抑制鈣質(zhì)流失的治療方式，而受研究開(kāi)發(fā)所限，促進(jìn)鈣質(zhì)再吸收的藥物市場(chǎng)占有量較少。因此，采用快速高效的活體動(dòng)物模型進(jìn)行藥物篩選，對(duì)藥物的開(kāi)發(fā)和疾病的治療具有重要的意義。

斑馬魚(yú)為近年來(lái)被廣泛用于疾病模型建立和藥物研發(fā)的重要的載體模式生物[3-5]，具有個(gè)體小、易于飼養(yǎng)、胚胎透明易于觀察和操作、樣品用量少、實(shí)驗(yàn)周期短和可實(shí)現(xiàn)高通量篩選等優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)代研究表明，其骨骼形成機(jī)制與哺乳動(dòng)物一樣，且其參與調(diào)控的關(guān)鍵基因與哺乳動(dòng)物的相關(guān)基因具有高度的同源性[6-7]，此為建立斑馬魚(yú)骨骼礦化活性篩選提供了生理及遺傳學(xué)依據(jù)。

氨基葡萄糖鹽酸鹽為甲殼素的一種衍生物，是其在濃鹽酸的作用下，酰胺完全水解并與鹽酸作用而形成的鹽，是一種重要的營(yíng)養(yǎng)素[8]，對(duì)人體具有重要的生理功能，能夠促進(jìn)人體粘多糖的合成，提高關(guān)節(jié)滑液的粘性，改善關(guān)節(jié)軟骨的代謝，提高軟骨細(xì)胞的修復(fù)能力，并可預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的破壞及關(guān)節(jié)周?chē)M織的炎癥[8-11]。臨床上，氨基葡萄糖鹽酸鹽被廣泛地用于骨關(guān)節(jié)炎治療，療效顯著，安全可靠，可有效提高患者的生活質(zhì)量，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值和意義[12-15]。淫羊藿為小檗科植物淫羊藿EpimediumbrevicornuMaxim、箭葉淫羊藿E.sagittatumMaxim、柔毛淫羊藿E.pubescensMaxim. 或朝鮮淫羊藿E.koreanumNakai的干燥葉，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨和祛風(fēng)濕的作用，臨床上常用于骨質(zhì)疏松癥的治療。現(xiàn)代藥理研究表明，淫羊藿能夠抑制破骨細(xì)胞形成，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化[16-18]。

目前有關(guān)氨基葡萄糖鹽酸鹽及淫羊藿提取物的活性評(píng)價(jià)多采用體外細(xì)胞模型或者是傳統(tǒng)的載體動(dòng)物模型，如大鼠、小鼠等，較少采用載體斑馬魚(yú)模型進(jìn)行生物活性篩選，特別是氨基葡萄糖鹽酸鹽，目前尚無(wú)有關(guān)斑馬魚(yú)模型的活性篩選的報(bào)道；而有關(guān)淫羊藿總提物或者是單體化合物的斑馬魚(yú)模型的活性篩選的報(bào)道，則主要集中于茜素紅染色法的抗骨質(zhì)疏松模型的活性評(píng)價(jià)，目前尚無(wú)采用鈣黃綠素染色法直接對(duì)活體斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨骼礦化程度進(jìn)行評(píng)價(jià)的報(bào)道。本研究采用鈣黃綠素染色法，對(duì)氨基葡萄糖鹽酸鹽和淫羊藿提取物促進(jìn)斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨骼礦化的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期探討此方法用于促進(jìn)骨骼礦化藥物的早期、快速發(fā)現(xiàn)的可行性。

1材料

1.1儀器

SZX16型體式熒光顯微鏡鏡(日本奧林巴斯公司)；HPG-280BX光照培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；斑馬魚(yú)養(yǎng)殖飼養(yǎng)設(shè)備(北京愛(ài)生科技公司)。

1.2試劑及試藥

鈣黃綠素(美國(guó)SIGMA公司，102500143)，純度大于99%；氨基葡萄糖鹽酸鹽(曲阜市圣嘉德生物科技有限公司)，純度大于99%；淫羊藿提取物購(gòu)自陜西恒德堂植物原料有限公司，規(guī)格為10:1(質(zhì)量比，10份原料提取得1份浸膏)，蘆薈苷含量不低于10%；所用其他試劑和試藥均為分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

AB品系斑馬魚(yú)，魚(yú)種由山東省科學(xué)院斑馬魚(yú)藥物篩選平臺(tái)提供。斑馬魚(yú)在14 h光照和10 h黑暗的光周期28 ℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)用水含5.00 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl,0.4 mmol/L CaCl2，0.16 mmol/L MgSO4。

2方法

2.1藥物溶液的配制

氨基葡萄糖鹽酸鹽溶液的配制：精密稱(chēng)取氨基葡萄糖鹽酸鹽約25 mg，用培養(yǎng)液溶解并定容至25 mL，作為母液，備用。實(shí)驗(yàn)前，用培養(yǎng)水稀釋成濃度分別為100、10和1 μg/mL的樣品溶液。

淫羊藿提取物溶液的配制：精密稱(chēng)取淫羊藿提取物約25 mg，用培養(yǎng)液溶解并定容至25 mL，作為母液，備用。實(shí)驗(yàn)前，用培養(yǎng)水稀釋成濃度分別為100、10和1μg/mL的樣品溶液。

鈣黃綠素染料的配制：精密稱(chēng)取鈣黃綠素約200 mg，用純凈水溶解并定容至100 mL，加入適量0.5 mol/L的NaOH水溶液，使染色劑的pH值調(diào)至7，放于4 ℃冰箱避光保存，備用。

2.2收集胚胎

收集受精卵前16 h，取健康性成熟純AB系斑馬魚(yú)，雌雄分開(kāi)，各兩條，放入有隔板的交配缸中，次日收集出板后1 h內(nèi)的受精卵，用干凈的胚胎培養(yǎng)水清洗胚胎3次，最后將胚胎移入干凈的胚胎培養(yǎng)水中，加入少量0.5%亞甲基藍(lán)溶液，放入保溫箱中28 ℃飼養(yǎng)3 d，其間須將已死亡的胚胎吸出。

2.3藥物對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的骨骼礦化作用的研究

第3天，選用發(fā)育正常斑馬魚(yú)幼魚(yú)放入24孔板中，每孔6條，用微量吸管將水盡量吸干，分別向其中加入已配好的高、中、低3個(gè)濃度的受試藥物溶液(氨基葡萄糖鹽酸和淫羊藿提取物)2 mL，并同時(shí)設(shè)立溶劑對(duì)照組(培養(yǎng)水)，置于保溫箱中飼養(yǎng)。每組樣品同時(shí)需再設(shè)2個(gè)復(fù)孔。隨后每天更換新配制的樣品溶液1 mL，連續(xù)更換3 d。第7天，將24孔板每個(gè)孔洞中的藥品溶液吸出，加入培養(yǎng)液約2 mL，洗去藥品靜置1 h，將培養(yǎng)液吸出，加入體積分?jǐn)?shù)為0.2 %的鈣黃綠素溶液 1 mL，避光染色1 h。將染劑吸出，用培養(yǎng)液清洗兩遍，靜置2 h，以便胚胎中多余的染劑釋出，再用培養(yǎng)液清洗至培養(yǎng)液無(wú)色[19-20]。

幼魚(yú)圖像采集前麻醉，使用SZX16型體式熒光顯微鏡，在放大倍率為5倍和2.5倍、曝光時(shí)間為2.8 s的條件下，對(duì)魚(yú)體中具有熒光染色的脊椎骨位置來(lái)進(jìn)行觀察以及拍照。

2.4數(shù)據(jù)分析

采用Image J影像定量軟件統(tǒng)計(jì)各組斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨骼的鈣黃綠素染色面積；采用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS 16.0)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用t檢驗(yàn)對(duì)各受試藥物組與溶劑對(duì)照組的染色面積進(jìn)行顯著性分析，P<0.01代表有顯著差異性。

a高濃度組100 μg/mL；　b中濃度組10 μg/mL；　c低濃度組 1μg/mL；　d溶劑對(duì)照組圖1　不同濃度的氨基葡萄糖鹽酸對(duì)斑馬魚(yú)骨骼發(fā)育的影響Fig.1　Impact of different concentrations of glucosamine hydrochloride on vertebrae growth of zebrafish

3結(jié)果及分析

3.1氨基葡萄糖鹽酸鹽對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨骼礦化的影響

不同濃度的氨基葡萄糖鹽酸藥物組對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的骨骼礦化均有一定的促進(jìn)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，且氨基葡萄糖鹽酸對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨骼礦化呈現(xiàn)一定程度的劑量依賴(lài)性，肉眼可見(jiàn)骨骼染色的根數(shù)隨著受試藥物濃度的降低而逐漸減少，表明其對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨骼的礦化作用逐漸降低。通過(guò)對(duì)各藥物組的斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨骼的鈣黃綠素染色面積的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)與溶劑對(duì)照組相比，各濃度藥物組的斑馬魚(yú)骨骼染色面積均多于溶劑對(duì)照組，且均呈現(xiàn)顯著性差異，P<0.01，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，表明在濃度為1 μg/mL～100 μg/mL的范圍內(nèi)，氨基葡萄糖鹽酸鹽對(duì)斑馬魚(yú)的骨骼礦化具有較明顯的促進(jìn)作用，即使在低濃度組，其仍具有較好的促進(jìn)骨骼礦化的作用。

a高濃度組100 μg/mL；　b中濃度組10 μg/mL；　c低濃度組 1 μg/mL；　d溶劑對(duì)照組**代表與對(duì)照組有極顯著性差異，P<0.01，n=6圖2　不同濃度的氨基葡萄糖鹽酸鹽對(duì)斑馬魚(yú)骨骼面積的影響Fig.2　Impact of different concentrations of glucosamine hydrochloride on bone area of zebrafish

3.2淫羊藿提取物對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨骼礦化的影響

不同濃度的淫羊藿提取物組對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的骨骼礦化均有一定的促進(jìn)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，且各藥物濃度組對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨骼礦化也呈現(xiàn)一定程度的劑量依賴(lài)性，肉眼可見(jiàn)骨骼染色的根數(shù)隨著受試藥物濃度的降低而逐漸減少，表明其對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨骼的礦化作用逐漸降低。通過(guò)對(duì)各藥物組的斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨骼的鈣黃綠素染色面積的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，各濃度的藥物組的斑馬魚(yú)骨骼染色面積均多于溶劑對(duì)照組的染色面積，且呈現(xiàn)顯著性差異，P<0.01，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，表明在濃度為1 μg/mL～100 μg/mL的范圍內(nèi)，淫羊藿提取物對(duì)斑馬魚(yú)的骨骼礦化具有較明顯的促進(jìn)作用。

4討論

本文采用鈣黃綠素活體染色的方式對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨骼進(jìn)行染色，具有實(shí)驗(yàn)周期短、染色時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單且不引起斑馬魚(yú)幼魚(yú)死亡等優(yōu)點(diǎn)，為促進(jìn)骨骼礦化藥物的早期、快速發(fā)現(xiàn)及動(dòng)態(tài)研究提供了一種方法，值得進(jìn)一步研究與推廣。

氨基葡萄糖鹽酸鹽及淫羊藿提取物，對(duì)斑馬魚(yú)的骨骼礦化均具有較好的促進(jìn)作用，此結(jié)果與氨基葡萄糖鹽酸鹽及淫羊藿提取物的體外細(xì)胞模型或者是傳統(tǒng)的載體動(dòng)物模型的活性篩選的結(jié)果一致，表明采用斑馬魚(yú)模型對(duì)藥物促進(jìn)骨骼礦化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。在藥物濃度為1 μg/mL～100 μg/mL的范圍內(nèi)，兩者對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨骼礦化作用都呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性，濃度越高，效果越好，且在低濃度時(shí)(1 μg/mL)仍表現(xiàn)出較好的活性，進(jìn)一步表明了體斑馬魚(yú)模型的高靈敏度特性，在低劑量就能反應(yīng)出藥物的生物活性。

a高濃度組100 μg/mL；　b中濃度組10 μg/mL；　c低濃度組 1 μg/mL；　d溶劑對(duì)照組圖3　不同濃度的淫羊藿提取物對(duì)斑馬魚(yú)骨骼發(fā)育的影響Fig.3　Impact of different concentrations of epimedium extract on vertebrae growth of zebrafish

a高濃度組100 μg/mL；　b中濃度組10μg/mL；　c低濃度組 1μg/mL；　d溶劑對(duì)照組**代表與對(duì)照組有極顯著性差異，P<0.01，n=6圖4　不同濃度的淫羊藿提取物對(duì)斑馬魚(yú)骨骼面積的影響Fig.4　Impact of different concentrations of epimedium extract on bone area of zebrafish.

在相同的藥物濃度下，氨基葡萄糖鹽酸鹽促進(jìn)斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨骼礦化的能力優(yōu)于淫羊藿提取物，因淫羊藿提取物為多種成分組成的一個(gè)復(fù)合物，經(jīng)進(jìn)一步提純分離后，可能表現(xiàn)出更好的促進(jìn)骨骼礦化的活性，需要在今后的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)研究。

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Evaluation of bone mineralization promotion of glucosamine hydrochloride and epimedium extract with zebrafish model

ZHANG Shan-shan, HE Qiu-xia, HAN Jian, WANG Xue, HOU Hai-rong, LI Xiao-bin,ZHANG Xuan-ming, HAN Li-wen*, LIU Ke-chun*

(Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors, Institute of Biology, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

Abstract∶We addressed the activity of bone mineralization promotion of different concentrations of glucosamine hydrochloride and epimedium extract based on zebrafish model. We selected 72 hpf normal growth zebrafish embryos as subjects, and cultivation water as control group or different concentrations (1, 10 and 100 μg/mL) of glucosamine hydrochloride solutions or epimedium extract solutions as experiment group. After four-day cultivation, all the zebrafish was dyed for 1 h with 0.2% calcein. We then observed their skeleton growth with a microscope, and calculated its stained area through an image analysis software. Results indicate that glucosamine hydrochloride and epimedium extract of all experiment groups all have some promotion effect on skeleton mineralization of zebrafish, as compared with control group, obvious dose dependence. This shows that both glucosamine hydrochloride and epimedium extract have significant bone mineralization activity to zebrafish. Moreover, glucosamine hydrochloride has better mineralization activity than epimedium extract for the same concentration.

Key words∶zebrafish; glucosamine hydrochloride; epimedium extract; bone mineralization

中圖分類(lèi)號(hào)：R965.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-4026(2016)02-0019-06

作者簡(jiǎn)介：張姍姍(1986-)，女，博士，研究方向?yàn)槌Ｓ弥兴幬镔|(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量評(píng)價(jià)。Email:qingshuibaikai@126.com*通訊作者，韓利文(1980-)，男，博士，研究方向?yàn)樗幬锖Y選及代謝組學(xué)研究。Email:hanliwen08@126.com劉可春(1964-)，男，博士，研究方向?yàn)樗幬锖Y選。Email:hliukch@sdas.org

基金項(xiàng)目：山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專(zhuān)項(xiàng)(2014ZZCX02105)；國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201505030)；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2015GSF121021)；2015年度煙臺(tái)市科技發(fā)展計(jì)劃(2015NC046)

收稿日期：2016-02-03

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.02.005