響應面法優化超聲波輔助提取桑葉多酚工藝

代燕麗 沈維治 廖森泰 劉凡 王思遠 胡根騰 鄒宇曉

摘 要 以‘粵椹大10品種的桑葉粉為原料，選擇乙醇濃度、料液質量濃度、超聲時間、超聲功率、超聲次數等5個因素做單因素實驗，在這個基礎上采用Box-Behnken中心組合試驗設計法進行3因素3水平的實驗，得到桑葉多酚提取的最佳工藝參數。最終得出的最佳提取工藝條件為：提取次數1次、超聲功率400 W、乙醇濃度70%（V/V）、料液質量濃度0.030 g/mL、超聲時間60 min，在此條件下桑葉多酚含量為8.33 mg/g。此結果的模型適合桑葉多酚超聲波提取，可用于實際生產。

關鍵詞 桑葉多酚；超聲波；提取；響應面；工藝優化

中圖分類號 TQ461；S888 文獻標識碼 A

Abstract The leaf powder of the mulberry variety‘Yueshen Da 10was used as the material. The box Behnken design was used to establish a quadric regression equation for predicting the yield of total polyphenols based on five factors including ethanol concentration， solid to solution ratio， ultrasonic treatment time， ultrasonic treatment power and ultrasonic treatment times. The optimized extraction conditions with a polyphenol yield of 8.33 mg/g were ethanol concentration 70%（V/V）， solid to solution ratio 0.030 g/mL， ultrasonic treatment time 60 min under ultrasonic treatment power 400 W for one time. The results of the model is fit for mulberry leaf polyphenol extraction and can be used in actual production.

Key words Mulberry leaf polyphenol； Ultrasonic； Extraction； Response surface methodology； Process optimization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.023

桑葉，為桑屬（Morus L.）桑科植物的葉，在全國大部分地區都有生產，品種資源極其豐富。現在研究證明，桑葉除了可用于蠶屬養殖外，在眾多領域都具有價值。而桑葉本身具有抗氧化、抗衰老、降血脂、降血糖、及抗癌等藥理活性，其中最主要的物質基礎[1]就是含有豐富的植物多酚，像綠原酸、蘆丁、安息香酸等單體酚類化合物的含量最為突出。沈維治等[2]已經做過有關桑葉多酚的含量與體外抗氧化能力的研究，研究證明桑葉多酚的抗氧化能力的生物活性與總多酚含量的相關性都達到極顯著水平（p<0.01），表明桑葉總多酚是桑葉抗氧化作用的重要物質基礎之一。由此，提高桑葉多酚的提取含量，對獲得更高生物活性的物質具有一定意義。超聲波輔助提取技術具有強大的超聲波能量，可以破碎植物細胞，改變原料的物化特性，加速目標物質的溶出[3]，是一種便捷、高效的提取方法，有研究報道超聲設備的功率和時間與提取產物的組成和數量密切相關[4-5]。目前，通過響應面分析法優化超聲波輔助提取桑葉多酚的研究還鮮有報道。本實驗將研究超聲波輔助法提取桑葉多酚工藝條件中料液質量濃度、乙醇體積分數、超聲時間和超聲功率等因素對桑葉多酚提取含量的影響，并通過響應面方法進行優化，研究結果能為桑葉資源的高附加值利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 ‘粵椹大10品種，于2015年3月中旬在廣東省農業科學院白云基地桑園采收。控制熱風干燥箱溫度為60 ℃，將樣品烘干至恒定重量，中藥粉碎機粉碎后過60目篩，-20 ℃陰暗環境貯藏備用。

1.1.2 試劑 Folin-Ciocalteu 試劑購自廣州市齊蕓生物技術有限公司，無水碳酸鈉、無水乙醇、沒食子酸等試劑都為國產分析純級。

1.1.3 儀器 永康市敏業工貿有限公司的百麗福-150中藥粉碎機，上海一恒科學儀器有限公司的電熱恒溫鼓風干燥箱，寧波新芝生物科技股份有限公司的SB25-12DTD超聲波清洗機，蘇州賽恩斯儀器有限公司的Thermo賽默飛世爾冷凍高速離心機Sorvall Strato，日本島津的UV-1800紫外分光光度計，上海愛朗儀器有限公司的EYELA-1001旋轉蒸發儀。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的建立 采用Folin-Ciocalteu[6]法以沒食子酸為標準品建立標準曲線。準確稱取10 mg沒食子酸標準樣品，去離子水定容至100 mL，配制成100 μg/mL標準樣品母液。將母液進行稀釋，配成濃度為4、6、8、10、12、14、16 μg/mL濃度的10 mL標準溶液。分別取1 mL不同濃度標準溶液、2 mL的10% Na2CO3溶液、1 mL福林-酚試劑振蕩混勻[7]，避光常溫反應1 h，在765 nm波長處用紫外分光光度計測定混合反應液的吸光度，每個試驗設置3個平行，取其平均值。實驗結果分別以沒食子酸質量濃度（μg/mL）、吸光度（OD）為X軸和Y軸，制作標準曲線并得出回歸方程和回歸系數。

1.2.2 桑葉多酚提取方法 準確稱取貯藏備用的‘粵椹大10桑葉粉加入不同濃度的乙醇，混合均勻后置入超聲環境（SB25-12DTD超聲波清洗機）下提取，旋轉蒸發儀減壓濃縮，用容量瓶定容到一定體積，按標準曲線建立的檢測方法檢測其中的多酚含量。每個樣品重復測定3次。

1.2.3 單因素試驗 分別研究乙醇濃度[50%、60%、70%、80%、90%（V/V），固定料液質量濃度為0.025 g/mL、超聲時間45 min、超聲功率400 W、提取1次]、料液質量濃度（0.020、0.025、0.030、0.035、0.04 g/mL，固定乙醇濃度70%、超聲時間45 min、超聲功率400 W、提取1次）、超聲時間（15、30、45、60、75 min，固定乙醇濃度70%、料液質量濃度0.03 g/mL、超聲功率400 W、提取1次）、超聲功率（100、200、300、400、500 W，固定乙醇濃度70%、料液質量濃度0.03 g/mL、超聲時間60 min、提取1次）、提取次數（1、2、3次，固定乙醇濃度70%、料液質量濃度0.03 g/mL、超聲時間60 min、超聲功率400 W）對桑葉多酚提取率的影響。實驗進行5個單因素試驗，為后面響應面優化試驗做準備。

1.2.4 響應面優化試驗 經過單因素試驗研究，選出對桑葉多酚含量影響合適的因素和水平，根據Box-Benhnken原理，用軟件設計試驗，進行響應面分析優化，獲得的試驗數據進行多元回歸擬合分析，得到最佳提取條件后并進行驗證試驗。每個試驗重復3次。

1.3 統計分析

采用SPSS19.0軟件對單因素試驗數據進行方差分析，并進行Tukey HSD差異顯著性分析（p<0.05表示差異顯著）。采用Expert-Design8.0.6分析響應面優化的數據建立回歸方程。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

分別以沒食子酸質量濃度（μg/mL）吸光度（765 nm）為橫縱坐標，做出標準曲線并得出回歸方程與回歸系數（圖1）。回歸方程為：y=0.053 1x+0.024 7，R2=0.999 3，表明沒食子酸濃度與吸光度在0～20 μg/mL范圍內，呈現良好的線性關系。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度對桑葉多酚提取含量的影響 由圖2可知，乙醇濃度對桑葉多酚提取含量的影響是呈規律性變化的，在乙醇濃度達到70%時，桑葉提取物多酚含量最高。在70%濃度以后，桑葉多酚提取含量逐漸降低，可能是因為溶劑揮發量增大，使桑葉粉得不到充分溶解，還有就是有部分醇溶性雜質溶出增加，干擾多酚化合物浸出。因此，乙醇濃度過低或過高均不利于桑葉多酚的提取，綜合生產成本和提取得率，選擇60%、70%、80% 這3個水平進行響應面優化試驗。

2.2.2 料液質量濃度對桑葉多酚提取含量的影響

從圖3可知，料液質量濃度對桑葉多酚含量的影響在0.030 g/mL時達到峰值，之后再增加料液質量濃度桑葉多酚含量逐漸降低，可能是溶劑體積一旦增大，其他一些可溶性的雜質溶解的量也逐漸增大，使得多酚提取含量減少。因此，選擇料液質量濃度0.025、0.030、0.035 g/mL 這3個水平進行進一步的響應面試驗。

2.2.3 超聲時間對桑葉多酚提取的影響 從圖4可以看出，在超聲時間60 min之前，隨著超聲時間的延長，桑葉多酚含量增加，當超聲時間到60 min以后再延長時間，多酚含量基本不變或有所降低，可能是因為超聲波強大的機械剪切作用對多酚類物質造成破壞所致[8]，還有隨著超聲時間越來越長，更多其他非多酚類雜質的溶出影響了多酚的提取。根據實驗結果，選取45、60、75 min 3個水平進行響應面試驗。

2.2.4 超聲功率對桑葉多酚提取的影響 從圖5可以看出，超聲波功率對桑葉多酚含量的影響從100 W到400 W是逐漸上升的，之后再增加超聲波功率，桑葉多酚含量基本保持不變。從節省能源的角度選擇400 W的超聲功率進行提取。

2.2.5 提取次數對桑葉多酚提取的影響 從圖6可以看出，提取次數對桑葉多酚提取含量影響不大，基本上沒有影響。提取1次后桑葉多酚含量已經達到穩定，提取次數再增加，桑葉多酚含量也不會有太大增加。因此選擇1次提取次數，這個因素不應用于響應面優化分析。

2.3 響應面優化試驗

2.3.1 試驗選擇的三因素三水平 綜合以上單因素試驗，采用Expert-Design8.0.6軟件將料液質量濃度、乙醇濃度、超聲時間3個對桑葉多酚提取含量影響較大的因素做響應面優化，確定相應的3水平（表1）并根據實驗設計進行試驗，得到最優提取方法。

2.3.2 響應面試驗 按照Box-Behnken中心組合試驗設計原理，得到桑葉多酚最優提取方案及結果（表2），回歸方程和方差分析結果（表3）。桑葉多酚超聲提取的回歸方程為：

y=8.33-0.17x1+0.045x2+0.056x3-0.28x1x2-0.22x1x3-0.11x2x3-0.62x12-0.4x22-0.23x32

式中x1為乙醇濃度，x2為料液質量濃度，x3為超聲時間，y為多酚含量。

由表3可知，失擬項P=0.241 2不顯著，模型p<0.0001，說明模型方程回歸顯著，擬合程度較好。料液質量濃度、超聲時間、料液質量濃度超聲時間的交互作用不顯著，但其他相均顯著；相關系數R2=0.960 5，表明自變量與相應值之間的關系顯著。綜合上述分析，3個因素對桑葉總酚提取都是極顯著的影響（p<0.01）。

2.3.3 響應面圖分析 根據回歸方程的結果，可以繪制出對應的響應面分析圖，直觀反映各因子的交互作用。從圖7立體圖中可以看出，乙醇濃度的變化曲面較陡，說明乙醇濃度對桑葉多酚含量影響大，與回歸方程得到的結果一致。從圖7的等高線圖可以看出，軸向乙醇濃度相對于料液質量濃度等高線密集，表明乙醇濃度對桑葉多酚含量影響較大，而料液質量濃度對桑葉多酚含量影響小。兩者交互作用圍成的等高線呈橢圓形，且等高線最小橢圓的中心在所選范圍之內，表明響應值（桑葉多酚提取含量）在3個因子設計的范圍存在最大值[9]。圖8中的乙醇濃度和超聲時間的交互作用顯示，隨著乙醇濃度增大和超聲時間的延長，桑葉多酚提取含量先升高后降低，在乙醇濃度接近70%，超聲時間60 min時的橢圓中心達到最大值，從而可以得出，保持適宜的乙醇濃度和超聲時間有利于促進桑葉多酚的提取；而就等高線密集程度來看，超聲時間比乙醇濃度對桑葉多酚提取含量的影響小。圖9中的料液質量濃度和超聲時間的交互作用顯示，隨著料液質量濃度增加和超聲時間延長，桑葉多酚的提取含量先升高后降低，在橢圓的中心位置料液質量濃度為0.030 g/mL、超聲時間60 min時，提取含量達到最大，而料液質量濃度和超聲時間的變化曲面相對平緩，說明這兩個因素對桑葉多酚含量影響不大，與上邊方差分析結果一致。

2.3.4 確定最佳工藝條件 通過響應面分析，實際中，桑葉多酚提取的多酚含量最高是8.35 mg/g，表4可見，此含量下對應的各因素條件為：乙醇濃度68.10%、料液質量濃度0.030 g/mL、超聲時間62.78 min。結合實際的操作條件，將最佳的工藝條件調整為：乙醇濃度70%、料液質量濃度0.030 g/mL、超聲時間60 min，在此條件下進行試驗驗證，得到多酚含量為8.33 mg/g，與理論值非常接近。

3 討論

響應面分析法是根據多元二次回歸方程作為函數估算工具，擬合因素與響應值之間的函數關系，來尋求最優工藝參數[10]。近年來，許多活性成分如多糖[11]、多酚[12]、花色苷[13]等的提取是運用響應面分析法輔助傳統有機溶劑進行提取試驗，在實驗過程中利用超聲波、微波等輔助提取植物活性物質成分，有效提高了生產效率和提取率。其中超聲波輔助提取法[14]是利用超聲波輻射壓強產生強烈的物理效應[15]，使溶劑內所有的分子振動頻率增加，加速目標成分進入溶劑，提高目標成分的提取率。

植物多酚包括可溶性酚和不溶性酚，組成復雜，在植物組織中的分布存在很大差異，因此提高桑葉多酚的提取含量應考慮到多個方面。前人在桑葉多酚提取工藝方面已經有一些研究報道，楊上鶯等[16]用正交設計的方法考察了桑葉多酚的制備工藝，該法與響應面法相比具有試驗方法繁雜、精度偏低等局限性。丁雙華等[17]利用響應面法優化桑葉多酚的乙醇浸提工藝，采用的是普通提取方法，未用到超聲波輔助提取，而普通提取方法繁瑣復雜，操作起來費時費力。本研究正是綜合響應面以及超聲輔助提取的各項優點，以超聲時間、超聲功率、料液質量濃度、提取溶劑等作為考察指標，全方位綜合試驗得到桑葉多酚提取的最佳工藝條件。

通過單因素試驗，選擇對多酚含量影響較大的因素，通過Box-Behnken中心組合試驗設計試驗方案并進行試驗，通過實驗得到的結果建立桑葉多酚超聲提取回歸方程，并進行實驗驗證，結果證明該模型的擬合度好。響應面圖分析得出，乙醇濃度極顯著的影響桑葉多酚的提取含量，而料液質量濃度和超聲時間對其影響不顯著。乙醇濃度和料液質量濃度兩兩交互作用、乙醇濃度和超聲時間兩兩交互作用對桑葉多酚的含量影響顯著。

實驗的最終結果明確并簡化了桑葉多酚的提取工藝，能更好的提供生物活性高的植物多酚樣品，并為以后批量生產桑葉多酚提供理論依據，提高桑葉的利用率。

4 結論

本研究通過響應面法優化超聲波輔助桑葉多酚提取工藝，得到最佳提取工藝為：乙醇濃度為70%，料液質量濃度為0.030 g/mL，超聲時間為60 min，超聲功率為400 W，提取1次，桑葉多酚提取含量為8.33 mg/g，達到理論預測值的98.8%，表明建立的二次數學模型對桑葉多酚提取工藝條件擬合度好。

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