香蕉中2條MaMLO基因的克隆及表達分析

賈彩紅 王卓 李健平 金志強 徐碧玉

摘 要 MLO基因是一類植物特有的抗病基因，為了研究香蕉MLO基因在香蕉抗枯萎病中的作用，利用RACE技術從香蕉中克隆獲得了香蕉2條MLO基因，分別命名為MaMLO1和MaMLO2。序列分析表明，MaMLO1的開放閱讀框為1 473 bp，編碼490個氨基酸；MaMLO2的開放閱讀框為1 689 bp，編碼562個氨基酸。系統進化樹分析表明，MaMLO1與已登錄的香蕉MLO1（XP_009413424）親緣關系較近，MaMLO2與已登錄的香蕉MLO6（XP_009411538）親緣關系較近。組織特異性研究表明，這2個基因在香蕉各器官中均有表達，但MaMLO2在根中的表達量最大。不同激素處理下的研究表明，MaMLO1受ABA、乙烯和水楊酸誘導上調表達，受茉莉酸誘導下調表達；MaMLO2受ABA、乙烯、水楊酸和茉莉酸4種激素誘導上調表達。在感病品種中2個基因均是下調表達，在抗病品種中均是上調表達。結果表明，克隆到的2條MLO在感病品種中沒有參與到香蕉抗枯萎病的過程，而在抗病品種中參與了香蕉抗枯萎病的過程。

關鍵詞 香蕉；MaMLO基因；克隆；表達分析

中圖分類號 S668.2 文獻標識碼 A

Abstract MLO is a kind of disease resistance genes in plant. In order to study the role of MaMLO in banana blight resistance， two MaMLOs named MaMLO1 and MaMLO2 were cloned from banana using the RACE technology. Sequence analysis showed that MaMLO1 had an open reading frame of 1 473 bp， encoding 490 amino acids； MaMLO2 had an open reading frame of 1 689 bp， encoding 562 amino acids. Phylogenetic tree analysis showed that MaMLO1 was close affinity to MLO1（XP_009413424）， MaMLO2 was close affinity to MLO6（XP_009411538）. Tissue specificity study showed that the two genes expressed in all organs of banana， but the biggest expression quantity of MaMLO2 was in the root. The study showed that the expression of MaMLO1 was induced to raise by ABA， ethylene and salicylic acid， while was induced to reduce by jasmonic acid； The expression of MaMLO2 was induced to raise by ABA， ethylene， salicylic acid and jasmonic acid. The expression of MaMLO1 and MaMLO2 was induced to reduce in cultivars， but raised in disease-resistant varieties. The results showed that the two MaMLOs were not involved in the process of the banana cultivars blight resistance， but they involved in resistant varieties.

Key words Banana； MaMLO； Cloning； Gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.007

香蕉是熱帶、亞熱帶發展中國家重要的農作物之一。其果實由于富含豐富的蛋白質和碳水化合物，是一些熱帶地區人民的主要糧食和國民收入的主要來源[1]。而香蕉枯萎病被認為是香蕉的“癌癥”，嚴重影響著香蕉的產量和質量。香蕉枯萎病是一種典型的土傳病害，是世界范圍內限制香蕉種植和產量的主要原因。該病是由尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f. sp. Cubense，Foc）引起的毀滅性土傳維管束病害，廣泛分布于世界各大香蕉主產區。香蕉易感枯萎病的機理十分復雜，其研究涉及到病理學、解剖學、生理學、生物化學和分子生物學等多個學科。有研究顯示枯萎病的發生是由于病原菌通過根系侵入植株輸導組織，病原體在木質部的導管中大量繁殖，這些繁殖體可以在蒸騰壓力的作用下隨導管運輸，隨著病原體的大量增殖，增殖的病原菌體可由一個導管運輸到另一個導管，大量繁殖的病原菌在導管內形成凝膠體，受感染的宿主分泌酚類化合物使堵塞的導管木質化而死亡[2]。

MLO基因家族是一類植物特有的抗病基因，是一個多基因家族，MLO基因對植物的抗病過程起負調控作用，在一定程度上相當于植物“感病”基因。任何感病的野生型（MLO）都可以通過誘變獲得MLO抗性。因此這類基因在改善植物抗性方面具有更大的潛力和應用前景。不同植物中的MLO基因拷貝數不同，擬南芥有15個[3]，水稻有12個[4]，高粱有13個[5]，葡萄有17個[6]，黃瓜有14個[7]。對不同物種的MLO基因結構和功能進行分析發現，MLO是一類比較保守的抗病基因。近年來部分物種的MLO基因在抗病中的功能已經得到驗證，包括水稻[8]、小麥[8-9]、擬南芥[10-11]、辣椒[12]等。

目前對MLO基因的研究主要集中在與白粉病相關的研究，而未見與香蕉枯萎病的相關報道，與激素、非生物脅迫相關的研究報道也較少。本研究從枯萎病菌（尖孢鐮刀菌生理4號小種）處理的巴西蕉根轉錄組中獲得了2個MLO基因片段，通過RACE技術從香蕉中獲得2條MLO基因全長序列，對其序列進行生物信息學分析，對在不同激素處理、香蕉感病品種和抗病品種中的表達進行分析研究，以期為香蕉MLO基因在香蕉抗病分子育種中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉（Musa acuminate L. AAA group cv. Brazilian）的根、莖、葉、花和果實（開花后100～120 d）從中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所澄邁香蕉種植園獲得。五葉一心的巴西蕉和抗病品種GCTCV119（M. acuminata L. AAA group，cv. Cavendish）從儋州香蕉組培苗廠購買獲得。

1.2 方法

1.2.1 激素處理 選取生長勢一致的五葉一心的巴西蕉，用100 mol/L的ABA溶液，100 mol/L的茉莉酸溶液，100 mol/L水楊酸溶液和1%（V/V）乙烯利溶液處理24 h后取樣，分別在0、6、12、24 h取樣，液氮速凍后于-70 ℃冰箱待用。每個處理重復3次。

1.2.2 菌液處理 分別選取生長勢一致的感病品種巴西蕉和抗病品種GCTCV119，利用Foc TR4侵染香蕉，香蕉植株在Foc TR4濃度為1.5×106 condia/mL的孢子懸浮液中浸泡2 h后，置于與上述培養條件相同的環境中培養，分別在0、2、4、6 d取樣（DPI）[13]，液氮速凍后保存于-70 ℃冰箱待用。每個處理重復3次。

1.2.3 RNA的提取和cDNA的合成 香蕉各種組織RNA的提取采用改良的CTAB法[14]。每個樣品取4 μg RNA，利用Invitrogen SuperScript TM IIIReverse Transcriptase合成cDNA第一鏈，具體反應體系和操作根據說明書進行。

1.2.4 香蕉MaMLO基因的克隆 RACE方法克隆香蕉中的MaMLO，根據已獲得的3′端完整的cDNA片段設計5′端引物（表1）。SMART RACE Kit 擴增5′端序列。拼接后，設計全長擴增引物（表1）利用香蕉根系cDNA文庫擴增全長序列。反應程序為：94 ℃變性7 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃終延伸10 min。獲得的序列利用BLASTn進行分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn），推導的氨基酸序列與香蕉DH-Pahang（AA組）基因組數據庫（http：//banana-genome.cirad.fr/greenphyl）進行比對，系統發育樹構建使用MEGA4[15]。

1.2.5 半定量RT-PCR 利用半定量RT-PCR對MaMLO基因在香蕉不同器官中的表達進行分析。所需引物見表1。PCR反應條件94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環，72 ℃終延伸10 min。MaActin作為內對照，每個反應重復3次。

1.2.6 熒光定量PCR 利用熒光定量PCR對MaMLO基因在枯萎病菌下處理后的表達進行分析。反應體系為：12.5 μL的2XSYBR Green PCR Master Mix，0.5 μL的ROX，100 ng的反轉錄RNA。所需引物見表1。反應程序為：94 ℃ 預變性3 min，94 ℃變性7 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40個循環。MaActin作為內對照，每個反應重復3 次。

2 結果與分析

2.1 基因的特征分析

對獲得的基因進行分析發現，MaMLO1基因的開放閱讀框為1 473 bp，編碼490個氨基酸，MaMLO2基因的開放閱讀框為1 689 bp，編碼562個氨基酸，這2條基因中均含有7個跨膜區，符合MLO基因的典型特征（圖1），因此將其命名為MaMLO。將克隆獲得的基因與2A基因組中的MLO基因進行比對，本研究中克隆獲得的MaMLO1基因與已經登錄的香蕉中的MLO1基因在核苷酸水平上的同源性為99.39%，氨基酸水平上的同源性為94.69%；與2A基因組中的MLO基因核苷酸水平上同源性為94.69%，氨基酸水平上的同源性為98.78%，MaMLO2與2A基因組中的MLO基因核苷酸水平上同源性為99.35%，氨基酸水平上的同源性為99.11%，與NCBI中已登錄的MLO6基因核苷酸水平上同源性為99.35%，氨基酸水平上的同源性為99.11%（表2）。說明克隆得到的這兩個基因是香蕉中的MLO基因。

構建遺傳進化樹發現，MaMLO1與已經登錄的香蕉中的MLO遺傳進化關系最近，與其他植物中的MLO的遺傳關系也比較近；而MaMLO2與已登錄的香蕉中的MLO6在同一分支上，與香蕉中MaMLO1遺傳關系較遠，與其他植物中的MLO遺傳關系也較遠（圖2）。

2.2 基因的器官特異性表達

利用半定量RT-PCR對MaMLO1和MaMLO2在香蕉不同器官中的表達進行分析，結果表明，MaMLO1在根、莖、葉、花和果中均有表達，但表達量變化不明顯，MaMLO2在根中的表達量最大，在莖、葉、花和果中的表達量基本一致（圖3）。

2.3 不同激素處理下的表達分析

利用熒光定量PCR技術對MaMLO1和MaMLO2在不同激素處理后根中的表達進行分析，發現MaMLO1受ABA和乙烯脅迫均是先下調表達，隨后上調表達，其表達情況成“V”字形狀；而在水楊酸脅迫下是先上調表達，隨后下調表達，在12 h其表達量最大，相對表達量為2.87；在茉莉酸脅迫下，其表達是下調的。MaMLO2均受ABA、乙烯、水楊酸和茉莉酸4種激素誘導上調表達，且表達量變化顯著，ABA、乙烯和茉莉酸誘導相對表達量最大值均出現在24時，分別為5.90、27.89、和18.95，而水楊酸誘導的最大值出現在12時，其相對表達量最大值為17.46（圖4）。

2.4 不同香蕉品種中的表達分析

對MaMLO1和MaMLO2在香蕉感病品種和抗病品種接種Foc TR4后的表達進行分析，發現在感病品種2個基因均是誘導下調表達，且下調表達量均呈極顯著差異，MaMLO2下調表達量比MaMLO1的下調表達量更大，MaMLO1的最小相對表達量為0.19，MaMLO2的最小相對表達量為0.13。在抗病品種中，這2個基因均是誘導上調表達，MaMLO1的相對表達量變化不明顯，MaMLO2的相對表達量變化在2 d和6 d呈極顯著差異，在4 d呈顯著差異，且最大值出現在6 d，為3.05（圖5）。

3 討論與結論

自從MLO基因在大麥中被發現以來，人們陸續在很多作物中發現了MLO基因，而原核生物、酵母和動物中均未發現該類基因的存在，說明MLO基因是植物所特有的。已有研究成果表明，MLO在許多作物里呈家族形式，具有多個家族成員，其中擬南芥中有15個家族成員、玉米中有9個、水稻中有12個家族成員，而在測序的香蕉2A基因組中有24個。研究中，克隆了香蕉中的2個MLO基因，推導的氨基酸編碼的MLO蛋白均具有跨膜結構，滿足MLO基因的基本特征；系統進化樹表明，本研究中克隆的MLO基因與NCBI中已登錄的香蕉MLO1基因和MLO6基因的同源性分別為99.39%和99.35%，但2個基因的長度不同，氨基酸同源性也較低，遺傳關系較遠，表明這2個基因屬于不同的亞家族，MaMLO1和MaMLO2在香蕉中所起的作用可能不同。

利用半定量PCR研究香蕉中的MLO基因在不同器官中的表達，MaMLO1在香蕉的根、莖、葉、花和果中均有表達，但在各組織中的表達量差別不明顯，而MaMLO2在根中的表達量較高，在其他器官中的表達量相對較低，說明該基因屬于組織特異性表達模式，可能與香蕉枯萎病相關。蘋果中與白粉病相關的MLO基因，其表達量在根中最大[23]，本研究結果與其有相似之處，即與病相關的MLO基因在根中的表達量最大，但蘋果白粉病是發生在葉片上，而香蕉枯萎病發生在根系中，其不同之處需進一步研究證明。

目前已有關于MLO基因在不同激素處理、不同脅迫處理后表達情況的研究報道。例如：小麥[16]、水稻[17]、甜瓜[18]、辣椒[19]和葡萄[20]中均有報道。辣椒中的MLO基因，受黃單胞菌誘導上調表達，在水楊酸、甲基紫精、氯化鈉和干旱處理后，其表達量也上調，但茉莉酸處理的其表達量下調[19]。說明辣椒的MLO基因不僅參與了抗病途徑，在非生物脅迫和激素脅迫方面也起作用。葡萄中不同的MLO基因，在傷害處理、水楊酸處理和雙氧水處理后，不同的MLO基因的表達模式不同，有的上調，有的下調，說明植物體內不同的MLO基因所起的作用不同[20]。本研究中香蕉中的MaMLO1和MaMLO2基因在不同激素處理后的表達模式有所不同，表明這2個基因在香蕉中對激素的反應不同。這與在辣椒和葡萄中的研究相似，即不同的MLO基因在植物體內所起的作用不同，說明不同植物中的MLO基因對不同脅迫處理的反應不同，所起的作用也不同。本研究中香蕉的2個MLO基因在4種激素處理后的表達結果說明，MaMLO2基因響應不同激素的程度均大于MaMLO1基因，說明在香蕉對外界激素反應強度方面，MaMLO2基因對激素的反應程度大于MaMLO基因，表明在香蕉反應激素方面MaMLO2的作用大于MaMLO1的作用。以上結果表明，植物的MLO基因不只與植物的抗病相關，可能與植物的非生物脅迫、植物的生長發育有關，體現了MLO基因功能上的多效性。

已有研究表明，MLO基因屬于抗病基因，在抗病過程中起負調控作用，小麥中的感病品種用白粉病菌處理后MLO基因的表達量在24 h后開始上升，72 h達到高峰，而在抗病品種中其表達量在18 h即出現了表達高峰，表明在抗病品種中MLO基因可能直接參與了抗病反應[21]。在蘋果中研究發現，在感染白粉病的莖段和葉中其表達量比健康的莖段和葉中表達量均有所增加[22]，這與我們的研究結果不同。本研究中發現，香蕉的感病品種和抗病品種用枯萎病菌處理后，在感病品種中，2個MLO基因的表達量下調，而在抗病品種中2個MLO基因的表達量上調，說明在香蕉感病品種中這2個MLO基因可能沒有參與到抗病反應中，而在抗病品種中可能參與了抗病反應，這與小麥中的研究結果不同。在香蕉感病品種中，MLO基因的表達量一直是下調，在抗病品種中一直上調，而在小麥感病品種和抗病品種中都是先上調隨后下調，這可能與不同的植物病害有關，白粉病是發生在葉片上的一種病害，而枯萎病是發生在根系中的一種病害，2種病害發生機制不同，推測MLO基因在不同的抗病途徑中所起的作用不同，小麥中的TaMLO8基因在小麥條銹病和白粉病兩種病害系統中所起的作用不同[23]也證明了這一點，但還需要進一步的研究證明。

本研究從香蕉中獲得了2條MLO基因，對其基因和推導的氨基酸序列進行了一些分析，對其組織研究表明，這2個基因參與了香蕉的生長發育過程；其對不同激素脅迫和香蕉枯萎病的響應說明這2個基因不僅響應非生物脅迫，而且響應生物脅迫。

參考文獻

[1] Aurore G， Parfait B， Fahrasmane L. Bananas， raw materials for making processed food products[J]. Trends in Food Science & Technology， 2009， 20（2）： 78-91.

[2] Ploetz R C. Fusarium wilt of banana is caused by several pathogens referred to as Fusarium oxysporum f. sp. cubense[J]. Phytopathology， 2006， 96（6）： 653-656.

[3] Devoto A， Hartmann H A， Piffanelli P， et al. Molecular phylogeny and evolution of the plant- specific seven-transmembrane MLO family[J]. J Mol Evol， 2003， 56（1）： 77-88.

[4] Liu Q， Zhu H. Molecular evolution of the MLO gene family in Oryza sativa and their functional divergence[J]. Gene， 2008， 409（1）： 1-10.

[5] Singh V K， Singh A K， Chand R， et al. Genome wide analysis of disease resistance MLO gene family in sorghum[Sorghum bicolor（l.）moench][J]. J Plant Genomic， 2012， 2（1）： 18-27.

[6] Feechan A， Jermakow A M， Torregrosa L， et al. Identification of grapevine MLO gene candidates involved in susceptibility to powdery mildew[J]. Functional plant biology， 2009， 35（12）： 1 255-1 266.

[7] 夏禮如， 錢春桃.黃瓜MLO型基因家族成員的鑒定及生物信息學分析[J]. 江蘇農業科學， 2013， 41（2）： 17-20.

[8] Elliott C， Zhou F， Spielmeyer W， et al. Functional conservation of wheat and rice Mlo orthologs in defense modulation to the powdery mildew fungus[J]. Mol Plant Microbe Interact， 2002， 15（10）： 1 069-1 077.

[9] 邢莉萍， 錢 晨， 李明浩， 等.小麥MLO反義基因的轉化及轉基因植株的白粉病抗性分析[J]. 作物學報， 2013， 39（3）： 431-439.

[10] Lorek J， Griebel T， Jones A M， et al. The role of Arabidopsis heterotrimeric G-protein subunits in MLO2 function and MAMP-triggered immunity[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2013， 26（9）： 991-1 003.

[11] Consonni C， Humphry M E， Hartmann H A， et al. Conserved requirement for a plant host cell protein in powdery mildew pathogenesis[J]. Nat Genet， 2006， 38（6）： 716-720.

[12] Kim D S， Hwang B K. The pepper MLO gene， CaMLO2， is involved in the susceptibility cell-death response and bacterial and oomycete proliferation[J]. Plant J， 2012， 72（5）： 843-855.

[13] Wang Z， Zhang J B， Jia C H， et al. De Novo characterization of the banana root transcriptome and analysis of gene expression under Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4 infection[J]. BMC genomics， 2012， 13（1）： 650.

[14] Asif M H， Dhawan P， Nath P. A simple procedure for the isolation of high quality RNA from ripening banana fruit[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2000， 18（2）： 109-115.

[15] Tamura K， Dudley J， Nei M， et al. MEGA4： molecular evolutionary genetics analysis（MEGA）software version 4.0[J]. Molecular biology and evolution， 2007， 24（8）： 1 596-1 599.

[16] Piffanelli P， Zhou F， Casais C， et al. The barley MLO modulator of defense and cell death is responsive to biotic and abiotic stress stimuli[J]. Plant Physiology， 2002， 129（3）： 1 076-1 085.

[17] Kim M C， Lee S H， Kim J K， et al. Mlo， a modulator of plant defense and cell death， is a novel calmodulin-binding protein isolation and characterization of a rice MLO homologue[J]. Journal of Biological Chemistry， 2002， 277（22）： 19 304-19 314.

[18] Cheng H， Kun W， Liu D， et al. Molecular cloning and expression analysis of CmMlo1 in melon[J]. Molecular biology reports， 2012， 39（2）： 1 903-1 907.

[19] Kim D S， Hwang B K. The pepper MLO gene， CaMLO2， is involved in the susceptibility cell‐death response and bacterial and oomycete proliferation[J]. The Plant Journal， 2012， 72（5）： 843-855.

[20] Feechan A， Jermakow A M， Torregrosa L， et al. Identification of grapevine MLO gene candidates involved in susceptibility to powdery mildew[J]. Functional plant biology， 2009， 35（12）： 1 255-1 266.

[21] 徐紅明， 劉紅彥， 王俊美， 等. 小麥MLO基因的克隆及白粉病菌誘導下的表達模式分析[J].麥類作物學報， 2010， 30（3）： 401-405.

[22] 李明想， 柏素花， 孫洪圳， 等. 蘋果白粉病相關基因MdMLO的克隆及表達分析[J]. 園藝學報， 2012， 39（增刊）： 2581.

[23] 孫燕飛， 李延生， 夏 寧， 等. 小麥TaMlo8基因的克隆及表達分析[J]. 西北農林科技大學學報， 2011， 39（10）： 101-110.