番木瓜NAC轉錄因子的克隆與表達分析

楊菲穎 申艷紅 耿姣姣 吳用 李科 陳曉靜

摘要 為探究番木瓜NAC轉錄因子的序列特征及功能，以‘大慶7號番木瓜果肉為試驗材料，采用RT-PCR克隆出2個不同的NAC類基因，命名為CpNAC1（GeneBank KT364871）和CpNAC2（GeneBank KT372241），其開放閱讀框（ORF）長度分別為609bp和805bp，分別編碼202個和268個氨基酸，其N端含有NAM保守結構域。采用實時熒光定量PCR研究其在乙烯利及清水對照處理后果實不同成熟時期中的表達情況，結果發現，CpNAC1和CpNAC2基因隨著處理后時間的增加，表達量呈先下降后緩慢上升的趨勢，且均與果實成熟呈負相關。但CpNAC1表達趨勢與果實成熟過程中乙烯的表達量相反，受乙烯抑制降低表達量，從而參與了番木瓜果實的成熟衰老進程，而CpNAC2基因在乙烯處理后番木瓜果實中表達量與對照處理相比沒有顯著變化，說明CpNAC2基因不是通過乙烯信號傳導途徑來調控果實成熟。

關鍵詞 番木瓜；NAC轉錄因子；基因克隆；果實成熟

中圖分類號 S667.9

文獻標識碼 A

Abstract In the present study， two novel NAC genes encoding NAC proteins in papaya， CpNAC1 and CpNAC2 were isolated from papaya fruit. The length of the cDNAs of CpNAC1 and CpNAC2 was 609 bp and 805 bp， encoding 202 and 268 predicted amino acids， respectively. Sequence analysis demonstrated that the CpNAC1 and CpNAC2 proteins contained NAM consecutive structural domain of the NAC superfamily. RT-qPCR analysis demonstrated that the expressing level of CpNAC1 and CpNAC2 dropped first and slowly increased afterward， and was negatively correlated with fruit mature. But the expression of CpNAC1 decreased significantly after ethephon treatment， indicating that CpNAC1 may be related to ethylene signal tansduction pathway. And CpNAC2 transcript levels had no change during ethephon treatment compared to the controls. These results suggests that the expression of CpNAC2 decrease in papaya fruit ripening and softening was not induced by ethylene.

Key words Papaya； NAC transcription factor； Gene cloning； Fruit ripening

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.008

NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2）轉錄因子是近年發現最大的具有多種功能的植物特異性轉錄因子。其蛋白最顯著的結構特點是N端含有150個氨基酸殘基組成的高度保守結構域，C端為高度變異的轉錄調控區，具有轉錄激活或抑制活性。研究結果表明，NAC轉錄因子家族在植物的生長和發育過程中發揮重要作用，包括頂端分生組織的形成，植物形態建成，葉片衰老，胚胎發育，類黃酮生物合成，側根的發育，次生細胞壁的形成。此外一些研究報道，NAC轉錄因子參與激素信號傳導，包括生長素、乙烯、脫落酸、赤霉素、水楊酸和細胞分裂素等。而且也參與植物對病原菌、真菌等生物的侵染以及干旱、低溫、高鹽、機械損傷等非生物逆境的抗逆反應。

近年來，NAC轉錄因子在果實衰老過程中的調控作用被廣泛地研究。Kou等研究發現，AtNAP基因對擬南芥長角果的衰老過程具有促進作用。Ma經試驗發現，番茄SlNAC1基因通過負調控乙烯的合成和信號轉導調節番茄果實的著色，通過正調控ABA合成調節番茄果實成熟。Shan等研究發現，香蕉MaNAC1/2影響乙烯信號途徑中下游基因EIN-3的表達，預測可能通過調節乙烯信號途徑參與香蕉果實的衰老過程。番木瓜作為具有重要經濟價值的果樹模式植物，屬呼吸躍變型果實且對低溫敏感，不利于運輸和貯藏，由于NAC轉錄因子具有降低乙烯信號傳導途徑，從而延緩果實衰老的功能，目前尚未見到有關番木瓜NAC轉錄因子的報道，因此，有必要探索番木瓜中NAC轉錄因子在果實衰老過程的調控機制。本試驗以番木瓜為材料，根據植物轉錄因子數據庫PlantTFDB中推測的番木瓜NAC轉錄因子氨基酸序列，利用RT-PCR等技術克隆NAC基因并對其進行生物信息學分析和表達分析，以期探明NAC在番木瓜果實成熟軟化中的功能，為耐貯運，長貨架期的番木瓜分子育種提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料及菌種 選擇表面完好、無機械損傷、大小均勻一致的綠熟期‘大慶7號番木瓜果實為試驗材料，在25℃進行乙烯利及清水對照處理，將果實分別用0.5g/L的乙烯利水溶液和清水浸泡3min，自然晾干后，用體積為62.5cm3的泡沫箱裝箱密封2h，處理后將果實放在25℃房中儲藏。將處理后6、12、24h和3d的番木瓜果實去除果皮和種子，果肉切成2mm×2mm×2mm的塊狀，用液氮速凍后于-80℃貯存備用。大腸桿菌菌株DH5a為本實驗室保存。

1.1.2試劑 ExTaq、dNTPs、18-T載體購自TaKaRa公司，瓊脂糖膠回收試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，Super SMART PCR cDNA Synthesis Kit購自BD Biosciences Clontech公司，通用RNA提取試劑盒R1051、SYBR ExScript試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1總RNA提取和反轉錄 使用東盛生物通用RNA提取試劑盒R1051提取番木瓜果肉RNA，并利用紫外分光光度計Q-5000和瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度和純度后，參照Super SMART PCR cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書，以番木瓜果肉RNA（200ng）為模板合成雙鏈cDNA，于-20℃保存備用。

1.2.2PCR引物的設計與合成 利用植物轉錄因子數據庫PlantTFDB（plant transcription Factor Database）plantffdb.cbi.pku.edu.cn/index.php）]，得到推測的番木瓜（Carica papaya）NAC轉錄因子家族的82個氨基酸序列，利用NCBI中的tBlastn工具獲得番木瓜82個轉錄因子的編碼序列。利用Primer5.0在開放閱讀框的兩側設計特異引物（見表1）。引物合成及基因測序工作均由上海鉑尚生物技術有限公司完成。

1.2.3番木瓜NAC基因cDNA克隆 以‘大慶7號番木瓜果肉cDNA為模板，進行PCR擴增。反應體系為25μL體系。PCR反應程序為：94℃3min；94℃30s，53℃30s，72℃1min，35次循環：72℃7min。擴增PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的條帶割膠回收，連接18-T載體并轉化DH5a，菌液鑒定后測序。

1.2.4生物信息學分析 利用Primer5.0軟件進行引物設計：利用DNAMAN軟件進行序列拼接和蛋白質翻譯：Blastn和Blastx（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行基因及蛋白質同源性搜素：使用Swissport（http：//www.expasy.ch/sprot/）和PFAM（http：//pfam.sanger.ac.uk/）進行氨基酸序列結構域分析：利用SignalP4.1Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）對氨基酸序列信號肽進行預測：用SOPM法進行蛋白質二級結構分析：用Phyre2（id=index）進行蛋白質三維結構分析：用MEGA 6.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建分子進化樹。

1.2.5NAC類基因的表達分析 提取500μg/L乙烯利和清水處理后6、12、24h和3d的番木瓜果肉RNA，將逆轉錄得到的cDNA（500ng/L）稀釋3倍作為qRT-PCR的模板，以CpActin為內參，qCpNAC1-F，R和qCpNAC1-F（R分別為2個NAC類基因的上下游引物）檢測NAC類基因在番木瓜不同成熟時期不同處理的表達水平，序列見表1。qRT-PCR反應體系為10μL體系：SYBR Mix 4μL，PCRforward primer（10mol/L）0.2μL，PCR Reverse primer（10mol/L）0.2μL，cDNA 1μL，ddH₂O 4.6μL，每個樣品4次重復。利用三步法擴增程序：94℃3min，95℃15s，60℃30s，72℃20s。40次循環。將清水處理后6h的表達量作為相對參照。定義為1。采用2^-△△Ct法進行相對表達量的分析，用SPSS19.0進行鄧肯氏多重比較。

2結果與分析

2.1番木瓜NAC類基因的克隆與序列分析

以番木瓜果肉cDNA為模板，擴增獲得兩條條帶，與預期基因片段大小一致（圖1），挑陽性克隆送檢。測序結果顯示。2條基因的開放閱讀框（ORF）分別為609bp和805bp，共編碼202個和268個氨基酸。將2個基因分別命名為CpNAC1、CpNAC2，GenBank登錄號為KT364871、KT372241。

2.2番木瓜NAC的生物信息學分析

將CpNAC1、CpNAC2基因的氨基酸序列在NCBI網站上進行CDD搜索（圖2），保守結構域分析表明，CpNAC1的N端8～138位氨基酸、CpNAC2的N端26～117位氨基酸，都為NAM保守結構域。利用DNAMAN6.0軟件將基因CpNAC1、CpNAC2開放閱讀框翻譯成氨基酸序列，進行同源序列比對分析，CpNAC1同擬南芥Arabidopsis thaliana（NP_201258.2）、煙草Nicotiana tabacum（XP_009762857.1）、草莓Fragaria vesca subsp.（XP 004309284.1）、葡萄Vitis vinifera（XP_002264894.3）、甜橙Citrus sinensis（XP_006432173.1）、楊樹Populus trichocarpa（XP_002310519.1）的同源性分別為97%、99%、100%、100%、100%，CoNAC2同可可Theobroma cacao（XP_007017462.1）、麻瘋樹Jatropha curcas（XP_012071783.1）、蓖麻Ricinus communis（XP_002510344.1）的同源性分別為97%、98%、100%，說明NAC轉錄因子氨基酸序列高度保守。

為研究NAC的進化關系，用MEGA6.0軟件構建11種高等植物的NAC系統進化樹，結果見圖3所示，CpNAC1和CpNAC2分別屬于2個分支，與CpNAC1親緣關系最近的是草莓，同屬于草本果樹。CpNAC2與可可、蓖麻、麻瘋樹親緣關系較近。CpNAC1和CpNAC2都與單子葉植物水稻進化距離相對較遠。

2.3番木瓜NAC轉錄因子的蛋白結構預測分析

利用Protparam等在線工具預測2種番木瓜NAC轉錄因子蛋白的基本理化性質（表2），2種番木瓜NAC都屬于親水性和不穩定性蛋白。經跨膜螺旋分析，CpNAC1的跨膜螺旋數均為0，未形成跨膜區域，不是膜蛋白：CpNAC2在膜內跨膜螺旋數為0，膜外跨膜螺旋數為1，即結合在膜外側，屬于膜蛋白，可能與信號轉導相關。2種番木瓜NAC蛋白不存在信號肽。為非分泌蛋白。通過SOPM法對2種番木瓜NAC轉錄因子家族蛋白進行預測分析，結果表明。CpNAC1由28.71%α-螺旋、16.83%延伸鏈、9.90%β-轉角和44.55%隨機卷曲組成。CpNAC2由27.24%α-螺旋、18.28%延伸鏈、10.45%β-轉角和44.03%隨機卷曲組成。

以Phyre2工具預測番木瓜2種NAC蛋白的三級結構（圖4），可以看出α-螺旋、延伸鏈、β-轉角和隨機卷曲的二級結構為折疊方式。CpNAC1和CpNAC2兩蛋白具有相似的三級結構，其中CpNAC1較CpNAC2多一個α-螺旋。

2.4CpNAC基因在番木瓜不同成熟時期的表達

試驗中觀察到乙烯利處理和清水處理24h后的番木瓜果實特征見圖5。從圖5可見，2個處理從果皮顏色上比較無顯著差異，都為綠色，但乙烯利處理的番木瓜24h開始軟化，果肉大面積變黃，而此時期清水處理的果肉仍然硬度較大，果肉顏色較淺。

應用qRT-PCR法檢測CpNAC在番木瓜中乙烯利和清水對照處理后6、12、24h和3d果實中的表達水平，結果如圖6所示，其中CpNAC1和CpNAC2隨著處理后時間的增加，表達量呈先下降后緩慢上升的趨勢，且表達量均低于6h的對照組，說明這2個轉錄因子的表達與果實成熟呈負相關。其中，CpNAC1經外源乙烯處理，在24h時表達量達到最低，顯著低于清水處理后該時期的表達量，表明該基因的轉錄水平受乙烯的負調控。CpNAC2表達量在處理后24h最低，不同時期外源乙烯處理的表達量與清水處理變化無顯著差異，說明該基因在果實成熟過程受乙烯調控不明顯。以上結果說明，CpNAC1表達趨勢與果實成熟過程中乙烯的表達量相反，受乙烯抑制降低表達量，從而參與了番木瓜果實的成熟衰老進程，而CpNAC2基因在乙烯處理后番木瓜果實中表達量與對照處理相比沒有顯著變化，說明CpNAC2基因不是通過乙烯信號傳導途徑來調控果實成熟。

3討論與結論

NAC作為最大的植物特異性轉錄因子家族，在擬南芥和水稻中已有許多NAC類基因被克隆并鑒定出來，本試驗首次從番木瓜中分離出了2個NAC類基因CpNAC1，CpNAC2的全長cDNA。根據保守結構域分析，CpNAC1和CpNAC2轉錄因子的N端為高度保守的NAC結構域。本試驗結果豐富了番木瓜NAC轉錄因子家族成員及其遺傳背景。為后人的研究提供理論參考。進化樹分析結果表明，CpNAC1和CpNAC2都與單子葉植物水稻進化距離相對較遠，CpNAC1與草莓親緣關系最近，CpNAC2與可可、蓖麻、麻瘋樹親緣關系較近。蛋白的三級結構分析發現蛋白結構較相似，但CpNAC1蛋白較CpNAC2蛋白多1個α-螺旋，該結構的差異是否是導致兩蛋白功能差異的主要原因尚需進一步研究證實。

果實衰老是一個復雜的生理生化過程，受到眾多基因和生物途徑調控，包括轉錄因子的調控。許多轉錄因子參與了果實衰老過程，如AP2、bZIP、MYB、WRKY、MADS、NAC等。在許多植物中發現，NAC轉錄因子的表達受到乙烯的誘導和抑制。番木瓜屬于典型的呼吸躍變型果實，在果實成熟起始會釋放大量的乙烯并且伴隨著呼吸速率的迅速增加。為深入了解番木瓜NAC的功能，筆者對番木瓜果實進行了外源乙烯處理和清水處理后不同時間NAC類基因表達量檢測。結果說明，CpNAC1、CpNAC2伴隨果實衰老，表達量均低于6h的對照組，說明這2個轉錄因子的表達均與果實成熟呈負相關。Ma等研究發現過表達SlNAC1抑制乙烯釋放，延緩果實衰老：Shan等研究中發現MaNAC1、MaNAC2在外源乙烯利的誘導下轉錄水平大大提升。而CpNAC1表達趨勢與果實成熟過程中乙烯的表達量相反，受乙烯抑制降低表達量，CpNAC2基因在乙烯處理后番木瓜果實中表達量與清水處理相比沒有顯著差異，借此推測，CpNAC1可能通過負調控乙烯的生物合成和信號傳導參與果實成熟衰老調控過程，CpNA C2基因不是通過乙烯信號傳導途徑來調控果實成熟，具體的調控途徑還需從轉基因等方面進一步研究。

本試驗從外源乙烯施加下基因的轉錄水平角度來初步預測CpNAC1、CpNAC2功能，為進一步深入探討番木瓜成熟衰老期間轉錄因子調控機制提供必要的理論參考，為耐貯運，長貨架期的番木瓜分子育種提供理論依據。

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