桂糖11號Rubisco基因克隆、原核表達及純化

吳朝興 蔣媛 王露蓉 顧彩彩 牛俊奇 孫波 李楊瑞 楊麗濤

摘要：【目的】通過原核表達及純化獲得甘蔗1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）的大、小亞基融合蛋白，為獲得符合抗體制備條件的高純度融合蛋白提供技術支持。【方法】以甘蔗品種桂糖11號（GT11）+1葉為材料，根據NCBI公布的甘蔗Rubisco大、小亞基基因（rbcL和rbcS）的編碼域序列（CDS）設計特異性引物，PCR擴增rbcL和rbcS基因的CDS，然后連接至原核表達載體pET-30a（+），構建重組質粒后轉入原核細胞（大腸桿菌Rosetta）中誘導表達，用鎳親和層析柱對融合蛋白進行純化，并比較分析桂糖11號與其他甘蔗品種在rbcL和rbcS基因的CDS及編碼蛋白序列方面的差異。【結果】rbcL和rbcS基因的CDS長度分別為1431和510 bp，其中桂糖11號rbcL基因的CDS與Saccharum hybrid cultivar SP80-3280（GenBank登錄號AE009947）、Saccharum hybrid cultivar Q155（GenBank登錄號KU214867）的一致，桂糖11號rbcS基因的CDS與Saccharum hybrid cultivar GT28（GenBank登錄號JN591757）的存在7個堿基差異，但僅有2個氨基酸發生錯義突變。RbcL和RbcS融合蛋白以包涵體形式存在原核細胞中，用鎳離子親和層析純化及超濾濃縮后其濃度均在1.0 mg/mL以上。【結論】從桂糖11號成功克隆Rubisco大亞基和小亞基基因的CDS，大亞基基因的CDS比小亞基的保守性更高，且均可在原核細胞中高度表達，經純化濃縮獲得的高純度融合蛋白可用于制備Rubisco單克隆抗體。

關鍵詞： 甘蔗；1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）；克隆；原核表達；融合蛋白；純化

中圖分類號： S566.1；Q785 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）04-0524-06

0 引言

【研究意義】甘蔗是我國第一大糖料作物，蔗糖產量占全國食糖產量的90%以上（李楊瑞和楊麗濤，2009；Li and Yang，2015），也是重要的能源和飼料作物。光合作用是綠色植物生長發育所需能量的來源，也是異養生物所需碳源的最終來源。在綠色植物中，光合作用發生在葉綠體中，而1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）參與催化光合碳同化的第一步反應，是光合作用中決定碳同化速率的關鍵酶。因此，克隆甘蔗Rubisco基因并制備Rubisco單克隆抗體對甘蔗光合機理研究，尤其是Rubisco特性研究具有重要意義。【前人研究進展】Wildman和Bonner在1947年發現了Rubisco，當時命名為部分I蛋白，并于1965年從菠菜中提純該酶，發現其具有催化CO2和RuBP形成PGA的能力（李鳳玲和吳光耀，1996）。高等植物的Rubisco是由8個大亞基（50～60 kD）和8個小亞基（12～18 kD）組成的16聚體蛋白（L8S8）（Andersson and Backlund，2008），其三維結構也已明確（Andersson et al.，1989），其中，大亞基由葉綠體基因組編碼，基因呈連續性，在葉綠體中轉錄翻譯；小亞基則由核基因組編碼，有內含子，在細胞質中合成（Yamazaki et al.，2005）。一個葉綠體DNA（Chloroplast DNA，ctDNA）中只有一個Rubisco大亞基基因（rbcL），但其核基因組中有多個Rubisco小亞基基因（rbcS）家族（Sasanuma，2001）。近年來，人們對不同物種的Rubisco基因進行了多方面研究。Bedbrook等（1980）克隆獲得豌豆的rbcS基因并進行了測序分析；曹凱鳴等（1996）克隆獲得野生大豆的rbcS基因并進行序列分析；賀超英等（2001）克隆了大豆rbcS基因并進行轉錄分析；Thomas-Hall等（2007）克隆了香蕉rbcS基因并對其分子結構和系統進化進行分析；崔喜艷等（2014）克隆了大豆rbcS基因全長cDNA并成功進行原核表達。此外，多種植物的葉綠體基因組測序已完成，且被廣泛應用在進化研究中（黃瑤和馬誠，1994）。Coen等（1977）從玉米葉片葉綠體中克隆得到rbcL基因并證明大亞基是由葉綠體基因組所編碼；Valentin和Zetsche（1989）從紅藻質體基因組庫中篩選出rbcL基因并完成測序；劉曉慶等（2011）成功克隆大豆rbcL基因并成功進行原核表達。【本研究切入點】雖然Rubisco免疫印跡（Western blotting）的相關研究很多，但商業化的Rubisco單克隆抗體較少，且國內鮮見針對甘蔗Rubisco的研究報道。【擬解決的關鍵問題】以甘蔗品種桂糖11號（GT11）DNA或RNA為模板克隆Rubisco大、小亞基的編碼區序列（CDS）全長，在大腸桿菌中誘導表達，通過鎳親和層析柱純化獲得融合蛋白，為研究甘蔗Rubisco基因及制備單克隆抗體提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

桂糖11號于2014年6月20日采自廣西大學甘蔗實驗田。大腸桿菌DH5α和Rosetta菌株由廣西大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室生物質能源實驗室提供，pET-30a（+）表達載體由廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室保存，內切酶和T4連接酶購自美國Thermo Scientific公司，同源連接試劑盒ClonExpress MultiS購自南京諾唯贊生物科技有限公司，質粒提取試劑盒BioSpin Plasmid DNA Extraction Kit、PCR純化試劑盒BioSpin PCR Purification Kit和膠回收試劑盒BioSpin Gel Extraction Kit購自日本BioFlux公司，反轉錄試劑盒PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA合成酶和Ex Taq購自寶生物工程（大連）有限公司，TRIzon總RNA提取試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司，鎳填充物Ni Sepharose Excel購自美國GE公司，其他試劑均為國產分析純。主要儀器設備：MALDI-TOF-TOF質譜儀（美國AB公司），TProfessional Thermocycler PCR儀（德國Biometra公司），NanoPhotometerTM P- Class微量分光光度計（德國IMPLEN公司），Amicon Ultra-15 10K超濾管（德國Millipore公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 DNA和RNA的提取 采集桂糖11號宿根蔗+1葉，利用改進的SDS法提取甘蔗葉片總DNA（黃東亮等，2010），參照TRIzol總RNA提取試劑說明提取葉片總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總DNA和RNA，以NanoPhotometerTM P-Class測定總RNA濃度及純度。

1. 2. 2 逆轉錄合成cDNA 參照PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明，以總RNA為模板逆轉錄合成cDNA。

1. 2. 3 引物設計與合成 根據NCBI已公布甘蔗Rubisco rbcL基因的CDS（GenBank登錄號AE009947）和rbcS基因的CDS（GenBank登錄號JN591757），應用Vector NTI 10軟件分別設計rbcL和rbcS基因特異引物，并在引物中插入酶切位點（下劃線處）（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 4 目的基因擴增 rbcS基因的CDS PCR反應體系50.0 μL：10×Ex Taq Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4.0 μL，上下游引物（10.0 μmol/L）各2.0 μL，cDNA模板2.0 μL，Ex Taq 1.0 μL，ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：98 ℃預變性5 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，進行30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物于10 ℃下保存，并取4.0 μL用于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。rbcL基因的CDS PCR反應體系50.0 μL：5×PrimeSTAR Buffer 10.0 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4.0 μL，上下游引物（10 μmol/ L）各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，PrimeSTAR HS DNA合成酶1.0 μL，ddH2O補足至50 μL。擴增程序：98 ℃預變性5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，進行30個循環；72 ℃延伸10 min。RCR產物于10 ℃下保存，并取2.0 μL用于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經膠回收后抽真空濃縮，-20 ℃保存。

1. 2. 5 大腸桿菌感受態的制備 首先加入30 mL預冷的0.10 mol/L MgCl2-CaCl2溶液（含0.08 mol/L MgCl2和0.02 mol/L CaCl2，經0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌），將大腸桿菌DH5α菌體重新懸浮，冰浴25 min后4 ℃ 4000 r/min離心10 min，棄上清液，然后將以上步驟重復一次，再將菌體懸浮于4 mL預冷的0.10 mol/L CaCl2和10%甘油的溶液中，分裝于EP管中，每個EP管100.00 μL，液氮速凍后于-80 ℃保存（謝翎等，2011）。

1. 2. 6 重組質粒的構建 用Kpn Ι和EcoR I于37 ℃下雙酶切rbcS基因和pET-30a（+）表達載體3 h，用EcoR V于37 ℃下酶切rbcL基因和pET-30a（+）表達載體3 h，用PCR純化試劑盒分別對其酶切產物進行純化，并用T4連接酶16 ℃連接3 h，分別轉入大腸桿菌DH5α中，涂到含卡那霉素的LA培養基上進行培養，提取轉化子質粒，通過重組質粒驗證，篩選出陽性菌株，送至深圳華大基因研究院測序。

1. 2. 7 重組質粒轉化及誘導表達 分別將pET-30a（+）和陽性重組質粒pET-30a-rbcS、pET-30a-rbcL轉入大腸桿菌Rosetta中，挑取陽性菌落置于含卡那霉素和氯霉素的LB培養基中進行擴大培養，當OD600為0.6～0.8時加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，28 ℃下150 r/min搖床培養過夜。收集菌體后菌體沉淀用Lysis Buffer（pH 8.0，NaH2PO4 50 mmol/L，NaCl 300.0 mmol/L，咪唑10.0 mmol/L）重懸菌體后置于冰水浴中超聲波裂解，離心后分別收集裂解上清液和沉淀，最后用12.5% SDS-PAGE進行檢測。

1. 2. 8 蛋白質質譜鑒定 取SDS-PAGE中的目的條帶送至亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，用MALDI-TOF-TOF質譜儀進行質譜鑒定。

1. 2. 9 融合蛋白的純化 取誘導表達后的重組菌，在冰浴中超聲波裂解，離心后收集沉淀，先用4.0 mol/L尿素洗滌沉淀，離心后棄上清液，再用8.0 mol/L鹽酸胍溶解沉淀，收集上清液；利用鎳親和層析柱純化上清液中的目的蛋白，每次上樣量約15 mg蛋白，按每2.0 mL為1管收集洗脫液（洗滌和洗脫用的咪唑溶液配制除咪唑濃度不同外，其他組分均與Lysis Buffer相同），用SDS-PAGE檢測融合蛋白，最后用Amicon Ultra-15 10K（Millipore）超濾管濃縮，SDS- PAGE檢測目的蛋白純度。

2 結果與分析

2. 1 目的基因PCR擴增結果

分別以cDNA和總DNA為模板，用所設計的引物對rbcS和rbcL基因進行PCR擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果如圖1所示，rbcS和rbcL基因條帶與預期結果（510和1431 bp）相符。

2. 2 重組質粒的構建

將rbcL和rbcS基因分別和pET-30a（+）載體連接，其連接產物轉入大腸桿菌DH5α，經含卡那霉素LA培養基的抗性篩選，獲得轉化子，提取其質粒，用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果（圖2）表明，目的基因已連接至pET-30a（+）載體，成功獲得重組質粒pET-30a-rbcL和pET-30a-rbcS。

2. 3 目的基因CDS分析

測序結果表明，已獲得rbcS和rbcL基因CDS，且在重組質粒上插入的位置讀碼框與載體讀碼框一致。其中，rbcS基因的CDS長度為510 bp，編碼169個氨基酸，相對分子量為19.105 kD，等電點為8.78；rbcL基因的CDS長度為1431 bp，編碼476個氨基酸，相對分子量為52.729 kD，等電點為6.33。經BLAST序列比對分析，發現桂糖11號rbcS基因的CDS與Saccharum hybrid cultivar GT28（GenBank登錄號JN591757）的存在7個堿基差異（圖3），分別為39T→C、76T→C、78A→C、126C→A、153T→G、282G→C和314G→A，但編碼的氨基酸序列中僅有2個氨基酸發生錯義突變，分別為26Ser→Pro和105Cys→Tyr，其他5個堿基突變均為同義突變。桂糖11號rbcL基因的CDS核苷酸序列與Saccharum hybrid cultivar SP-80-3280（GenBank登錄號AE009947）、Saccharum hybrid cultivar Q155（GenBank登錄號KU-214867）的一致。

2. 4 重組菌誘導表達及質譜鑒定

重組菌pET-30a-rbcS/Rosetta和pET-30a-rbcL/Ros-etta誘導表達獲得目的蛋白，經超聲波裂解后進行SDS-PAGE檢測。結果如圖4所示，rbcS和rbcL基因均在原核細胞中表達，且以包涵體的形式存在，蛋白質條帶大小約15.0和52.0 kD，與預期結果相符，且蛋白質質譜鑒定結果也表明，蛋白條帶分別為Rubisco小亞基和大亞基蛋白。

2. 5 RbcS和RbcL融合蛋白的純化及濃縮

對鎳親和層析（重力柱）純化體系不斷優化，最終獲得較好的純化效果，洗脫下來的小亞基和大亞基的純度和質量均能滿足制備抗體要求，超濾濃縮后濃度均在1.0 mg/mL以上（圖5）。

3 討論

本研究從甘蔗品種桂糖11號的+1葉中成功克隆Rubisco的rbcS和rbcL基因CDS，rbcS基因的CDS長度為510 bp，rbcL基因的CDS長度為1431 bp，其長度與NCBI上其他甘蔗品種一致，其中rbcL基因的CDS與Saccharum hybrid cultivar SP-80-3280和Q155的一致，但桂糖11號rbcS基因的CDS與Saccharum hybrid cultivar GT28的存在7個堿基差異，分別為39T→C、76T→C、78A→C、126C→A、153T→G、282G→C和314G→A，而編碼的氨基酸序列中有2個氨基酸發生錯義突變，分別為26Ser→Pro和105Cys→Tyr。這與前人的相關研究結果（Gontcharov et al.，2004）相似，進一步證明了大亞基基因序列在進化中高度保守，而核基因組編碼的小亞基保守性較差，且存在多個rbcS基因家族，可用于種間系統發育分析（Sasanuma，2001；Thomas-Hall et al.，2007）。在表達水平方面，大亞基和小亞基也存在差異，如魚腥藻的Rubisco大亞基表達量遠高于小亞基表達量，且多余的大亞基以不可溶的狀態存在，只有大亞基和小亞基形成完整且有活性的Rubisco時才可溶（Gurevitz et al.，1985）。本研究原核表達的RbcS和RbcL融合蛋白也均以包涵體形式存在，可推測即使換用更利于融合蛋白可溶性表達的載體及優化表達條件也無法實現可溶性表達。

本研究融合蛋白純化效果很好，超濾濃縮后測定其濃度均在1.0 mg/mL以上，且純化蛋白的總量在4.0 mg以上，蛋白質總量和純度均滿足制備單克隆抗體的要求，可用于其單克隆抗體制備與研究。由于單克隆抗體具有特異性強、便于人為控制的特點，因此制備Rubisco單克隆抗體有助于甘蔗Rubisco定量分析及其形態學分布觀察研究。

4 結論

本研究從桂糖11號成功克隆Rubisco大、小亞基基因CDS，大亞基的CDS比其小亞基的保守性更高，均可在原核細胞中高度表達，經純化濃縮可獲得的高純度融合蛋白可用于制備Rubisco單克隆抗體，有助于甘蔗Rubisco定量分析及其形態學分布觀察研究。

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（責任編輯 陳 燕）