葡萄黑痘病病原菌生長特性研究

林玲 陳立 李瑋 謝蜀豫 文仁德 陳國品 李洪艷 韓佳宇 盤豐平 白先進 曹慕明

摘要：【目的】探索葡萄黑痘病病原菌在不同培養條件下的生長情況，優化其培養條件，以縮短培養該菌純培養物的周期，提高培養效率。【方法】通過常規培養手段，從患黑痘病黑巴拉多病葉上分離葡萄黑痘病病原菌，PCR擴增該菌ITS片段，經測序后在NCBI比較該片段序列。用同一規格培養皿培養病原菌，每隔7 d觀察并統計該病原菌在4種不同培養基組分、5個不同溫度梯度、4個不同蔗糖濃度梯度、4種光照時間、5個不同pH條件下共計21 d的生長情況。【結果】分離到病原菌并擴增獲得其ITS片段，經比對，該片段序列與NCBI已公布葡萄痂囊腔菌序列AY826763的相似度達99.9%，證實所分離病原菌為葡萄痂囊腔菌（Elsinoe ampelina）。葡萄痂囊腔菌的生長最適培養基為PSA，其次是YEB；最適培養溫度為25 ℃、最適蔗糖濃度為4.5 g/L、最適pH為8，在最適培養溫度、蔗糖濃度和pH下病原菌的生長速度分別為0.07、0.03和0.01 cm/d；光照時間對葡萄痂囊腔菌生長影響不明顯。【結論】葡萄痂圓孢菌生長受環境條件影響，通過培養條件優化能顯著加快其生長速度，提高培養效率。

關鍵詞： 葡萄黑痘病；葡萄痂囊腔菌；培養條件；生長特性

中圖分類號： S436.8 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）04-0571-05

0 引言

【研究意義】葡萄黑痘病（Grape black pox）是危害葡萄的主要真菌病害之一，其病原菌有性態為葡萄痂囊腔菌[Elsinoe ampelina（de Bary） Shear]，無性態為葡萄痂圓孢（Sphaceloma ampelinum de Bary），由于該菌屬于寄生性真菌，營養要求苛刻，在實驗室中離體培養較困難（張劍俠等，2009；徐寧等，2014；劉會寧和李彬，2015），不利于對黑痘病的后續研究。因此，通過研究葡萄痂囊腔菌的生長特性，優化其培養條件，從而快速大量地獲得其純培養菌體，對于葡萄黑痘病研究有著重要意義。【前人研究進展】葡萄黑痘病害發生廣泛，嚴重影響葡萄的食用價值和商品價值。國內研究人員目前已對黑痘病的發生規律進行了一些研究，王倩（2011）研究發現，我國葡萄主產區除新疆和少數干旱地區外，均有葡萄黑痘病害發生；在春夏多雨潮濕的地區，黑痘病發病盛期為3月中旬～4月下旬，這段時間是防治黑痘病的關鍵時期。劉志剛（2006）調查發現葡萄黑痘病的發生與氣候因素（如大氣濕度、降雨等）密切相關，多雨高濕的環境不僅有利于黑痘病病菌分生孢子形成、傳播和萌發侵入，還能促使患病組織迅速生長，導致葡萄植株抵抗力下降，加重病害的發生；干旱年份或少雨地區則發病較輕。楊華等（2009）研究發現黑痘病菌能夠侵染葡萄的花穗、幼果、卷須和新生枝葉等幼嫩組織，嚴重影響葡萄的食用價值和商品價值，使葡萄各產區蒙受巨大的經濟損失。在葡萄黑痘病病原分離及培養方面的研究報道較少。肖歡等（2010）通過分子生物學手段分離得到黑痘病病原菌——葡萄痂囊腔菌。目前國內研究人員僅采用以葡萄糖為碳源的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基培養葡萄痂囊腔菌，沒有探索其生長特性，且生長至肉眼可見菌落時間長達3個月，難以快速有效地滿足后續對黑痘病研究的需求（王倩，2011）。【本研究切入點】目前對于葡萄黑痘病致病菌本身生長特性的研究尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】通過單因素試驗，對葡萄痂囊腔菌的培養條件進行優化，以加快該菌的生長速度，提高獲得純培養物的效率，為葡萄黑痘病研究提供菌源保障。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試葡萄品種為黑痘病高感品種黑巴拉多，取自廣西農業科學院明陽雙季葡萄示范基地種質資源圃。

供試主要試劑：三羥甲基氨基甲烷（Tris）、蛋白胨、酵母提取物、瓊脂為OXOID.LTD產品，Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（真菌）、ITS通用引物、Taq DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTP、100 bp Plus DNA Ladder為生工生物工程（上海）股份有限公司產品，NaCl、酒精、NaOH等均為國產分析純。

供試主要儀器：低溫離心機（Eppendorf，5804R，Germany）、常溫離心機（Eppendorf，5418R，Germany）、PCR儀（Eppendorf，5341，Germany）、烘箱（上海精宏 實驗設備有限公司，DHG-9123A型）、水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司，DK-8D）、高壓滅菌鍋（TOMY、SX-500，Japan）、恒溫搖床（上海智城分析儀器制造有限公司，ZHWY-2102）、超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司，SW-CJ-2FD）、微波爐（Galanz，P7021P- 61A）、電泳儀（北京六一儀器廠，DDY-6C型）、凝膠成像系統（SYNGENEG：BOX）、智能生化培養箱（黑龍江東拓儀器制造有限公司，SPX-2508）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 常用培養基配制 PSA培養基（1 L）：馬鈴薯（去皮）200 g，加水1000 mL煮沸30 min，紗布過濾，加入蔗糖10 g，瓊脂14 g，加熱充分溶解后，加水補足至1000 mL，最后分裝至三角瓶中，121 ℃高壓滅菌20 min后取出，冷卻備用。

YEB培養基（1 L）：酵母提取物6 g，蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，瓊脂7 g，加熱充分溶解后，加水補足至1000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min后取出，冷卻備用。

LB培養基（1 L）：胰蛋白胨（Tryptone）10 g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉15～20 g，加雙蒸水至1000 mL，用5 mol/L NaOH（約0.2 mL）調pH至7.2，121 ℃滅菌30 min。

CM培養基（1 L）：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂7 g，加熱充分溶解后，加水補足至1000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min后取出，冷卻備用。

1. 2. 2 葡萄痂囊腔菌的分離培養及純化 2014年4月，自廣西農業科學院明陽雙季葡萄示范基地葡萄種質資源圃患病黑巴拉多上摘取病葉片（圖1），置于冰壺中帶回實驗室，采用傳統方法分離黑痘病病原菌。將病葉置于密封袋中，用無菌水輕柔沖洗。在無菌操作臺上進行接種，在病葉上選取典型單一病斑，用滅菌解剖刀從病健交界處切取約1 cm2的小塊，在75%乙醇中振蕩3～5 s，用0.01%升汞在表面輕輕擦拭晾干，最后放入無菌水中漂洗晾干。將病組織接種在PSA培養基上，每皿接種4片材料，在25 ℃恒溫箱中暗培養。待菌落長出，用滅菌接種針在菌落邊緣挑取小塊，接至PSA斜面培養基上，在25 ℃恒溫箱中繼續培養。將分離得到的菌純化、繼續擴繁，培養成熟后用0.9% NaCl溶液將斜面上的孢子洗下制成2×106個/mL菌絲懸浮液。在陰天，隨機選取10株葡萄，用噴霧器噴施菌懸液接種黑巴拉多幼葉，另設1噴施清水對照，套袋保濕并觀察，待癥狀穩定后直接從病斑上刮取病原菌（沈國軍和徐祖榮，2010）。

1. 2. 3 葡萄痂囊腔菌DNA提取與rDNA-ITS區域核苷酸序列測定 使用生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（真菌）提取病原菌DNA，并略有改進。取冷凍干燥菌絲約0.2 g，在研缽中預冷，然后研磨成粉末，迅速將干粉末轉移，置于滅菌2 mL離心管中，在離心管中加入500 μL抽提緩沖液，55 ℃恒溫水浴50 min，期間每隔10 min輕輕振蕩混勻離心管內的緩沖液；待完成后，離心，輕輕吸取上清液至新離心管，加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），渦旋振蕩充分混勻，離心取上層水相；重復2次；離心后輕輕吸取上清液至新離心管，加1/10體積的3 mol/L NaAc（pH 5.2）和等體積異丙醇渦旋混勻，-20 ℃下靜置30 min；離心，棄上清液，用無水乙醇洗滌沉淀，將沉淀溶于30 μL TE緩沖液中，-20 ℃保存備用。

擴增所用引物為真菌ITS區通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）（林玲，2010；張劍俠等，2010）。PCR反應體系（20.0 μL）：10×PCR反應緩沖液2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌水10.3 μL。反應程序：94 ℃預變性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行30個循環；72 ℃延伸10 min。取擴增產物6 μL電泳檢測，在凝膠成像系統進行觀察并拍照。使用 DNA凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司，產品號DP209）回收目的DNA片段，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測得的ITS序列在NCBI網站中進行同源性比對分析（雷百戰和李國英，2004；尚晶晶，2010）。

1. 2. 4 葡萄痂囊腔菌培養條件篩選

培養基篩選：將葡萄痂囊腔菌接種于PSA培養基上，待菌落生長至d=50 mm時用無菌打孔器取d=3 mm的菌絲塊，分別轉接至4種真菌培養基（CM、LB、YEB、PSA）上，接種后的培養基在25 ℃暗培養，每處理重復3次。每隔7 d測量其菌落直徑并用肉眼觀察菌落厚薄。

培養基含糖量篩選：以蔗糖配制成濃度分別為3.0、4.5、6.0和7.5 g/L的PSA培養基，按上述方法接菌，置于28 ℃下培養，定時測定菌落直徑并觀察菌落厚薄。

培養溫度篩選：在5～30 ℃范圍內設置5種不同溫度（10、15、20、25、30）處理，按上述方法接菌，定時測定菌落直徑并觀察菌落厚薄。

光照條件篩選：分別在全光照、全黑暗、8 h光照/16 h黑暗和8 h黑暗/16 h光照條件下用PSA培養基在20 ℃下培養，接菌方法同上，定時測定菌落直徑并觀察菌落厚薄。

pH篩選：在PSA培養基上設置5種不同pH（4、6、8、10、12）處理，按上述方法接菌，定時測定菌落直徑并觀察菌落厚薄。

1. 3 統計分析

試驗所得數據采用Excel 2007和DPS 9.50數據處理系統軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2. 1 葡萄痂囊腔菌DNA提取與ITS片段擴增

使用真菌試劑盒提取葡萄黑痘病病原菌DNA，其帶型清楚可見（圖2-A），擴增得到長度為451 bp的ITS片段（圖2-B），擴增片段經回收，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，結果在NCBI比對，序列片段與已公布的葡萄痂囊腔菌序列AY826763的相似度達99.9%，證實所分離病菌為葡萄痂囊腔菌（Elsinoe ampelina）。

2. 2 葡萄痂囊腔菌培養條件優化結果

2. 2. 1 不同培養基對葡萄痂囊腔菌生長的影響 從表1可知，葡萄痂囊腔菌在4種培養基中均能生長，但生長速度不一致，在PSA和YEB培養基上病原菌生長比LB和CM培養基快，其中以在PSA培養基上的生長速度最快。差異顯著性分析結果表明，葡萄痂囊腔菌在PSA和YEB培養基上的生長速度顯著（P<0.05，下同）高于在LB和CM培養基上的生長速度，而在PSA與YEB培養基上的生長速度間無顯著差異（P>0.05，下同）。

2. 2. 2 不同蔗糖濃度對葡萄痂囊腔菌生長的影響

從表2可知，葡萄痂囊腔菌在蔗糖濃度3.0～7.5 g/L下均能生長，但生長速度不一致，其中在蔗糖濃度為4.5 g/L時生長最快，生長速度達0.03 cm/d。差異顯著性分析結果表明，蔗糖濃度4.5 g/L下的葡萄痂囊腔菌生長速度顯著高于在其他蔗糖濃度下的生長速度。

2. 2. 3 不同溫度對葡萄痂囊腔菌生長的影響 從表3可知，葡萄痂囊腔菌在10～30 ℃條件下均能生長，但生長速度不一致，其中在25 ℃下生長最快，平均生長速度達0.07 cm/d。差異顯著性分析結果表明，25 ℃條件下葡萄痂囊腔菌生長速度顯著高于在其他溫度條件下的生長速度。

2. 2. 4 不同光照條件對葡萄痂囊腔菌生長的影響

從表4可知，葡萄痂囊腔菌在不同光照條件下均能生長，且生長速度相近。差異顯著性分析結果表明，不同光照條件下病原菌生長速度差異不顯著。

2. 2. 5 不同pH對葡萄痂囊腔菌生長的影響 從表5可知，葡萄痂囊腔菌在pH 4時幾乎不生長，在pH 8時生長最快，平均生長速度為0.01 cm/d。差異顯著性分析結果表明，pH 8時葡萄痂囊腔菌生長速度顯著高于其他處理的菌落生長速度。

3 討論

本研究從感染黑痘病的黑巴拉多病葉片上分離、純化了病原菌并提取其DNA，PCR擴增得到其ITS片段，片段測序后與NCBI已公布葡萄痂囊腔菌序列AY826763的相似度達99.9%，證實所分離病菌正是葡萄黑痘病菌E. ampelina，與肖歡等（2010）研究所得結果一致。

通過統計在不同培養條件下葡萄痂囊腔菌的生長情況，明確了蔗糖濃度和培養溫度是影響該菌生長的最大因素。本研究結果表明，葡萄痂囊腔菌在PSA、LB、YEB和CM培養基上均可生長，但在PSA和YEB上生長較快，尤其在PSA培養基上生長最快，在LB和CM培養基上只能緩慢生長；葡萄痂囊腔菌在10～30 ℃下均可生長，PSA培養基上的病菌在25 ℃下生長速度最快，達0.07 cm/d；病菌在3.0～7.5 g/L的蔗糖濃度下均能生長，尤其在4.5 g/L濃度下生長速度最快，達0.03 cm/d；光照時間長短對葡萄痂囊腔菌生長影響不明顯；葡萄痂囊腔菌在pH 4～12條件下均能生長，但在pH 6～10生長較快，最適pH為8，與前人的研究結果（王倩，2011）一致。在目前已有的研究報道中，葡萄痂圓孢菌多在PDA上培養，菌落直徑可達1 cm，但生長周期長達3個月，生長速度為0.03 cm/d（肖歡等，2010；王倩，2011；劉昆玉等，2013），如此漫長的培養周期嚴重影響了后續對黑痘病防治研究工作的開展。本研究通過對葡萄痂圓孢菌實驗室培養條件進行篩選和調優，成功將其菌落生長至直徑1 cm的培養周期由3個月縮短至1個月，菌落生長速度提高了133%，極大縮短了黑痘病研究過程中獲取病原菌培養物的工作周期，為提高葡萄黑痘病研究的工作效率起到了推動作用。

4 結論

本研究從患黑痘病的黑巴拉多病葉上分離獲得黑痘病病原菌葡萄痂圓孢菌（E. ampelina）。葡萄痂圓孢菌生長受環境條件影響，其可在多種培養基上生長，其中對PSA培養基的利用最好；高濃度蔗糖對其生長有抑制作用；該菌生長不受光照的影響，在25 ℃下生長最好；其在pH 6～10下生長較好，生長環境偏堿性。可見，通過培養條件優化能顯著加快其生長速度，提高培養效率。

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（責任編輯 麻小燕）