枯草芽孢桿菌Czk1誘導橡膠樹抗病性相關防御酶系研究

唐文 梁艷瓊 許沛冬 張馳成 吳偉懷 鄭肖蘭 賀春萍 易克賢

摘要：【目的】研究生防枯草芽孢桿菌Czk1對橡膠樹體內防御酶活性的影響，探討其誘導橡膠樹抗病性機理，為Czk1在生物防治領域的應用打下基礎。【方法】以過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）5種防御酶作為植物抗病性反應指標，用Czk1菌株發酵液1倍原液及10、100倍稀釋液噴灑處理橡膠葉片，以噴灑LB液體培養基為對照，于不同時段測定各防御酶活性；按照生防菌與炭疽病菌接種順序的不同，測定橡膠樹炭疽病菌及生防菌對橡膠植株抗性相關酶活性的影響。【結果】經Czk1發酵液10倍稀釋液處理的橡膠樹葉片中CAT、POD、PAL和PPO 4種酶活性最高，誘導植株抗病性效果最佳，各酶活峰值分別達4264.62、28946.18、186.67和53.70 U/g，為對照組的5.24、6.34、3.19和3.38倍；而葉片中SOD活性最高的為Czk1發酵液1倍原液處理組，酶活峰值為1344.53 U/g，為對照組的5.19倍。先噴灑Czk1發酵液后接種病原菌的處理組，橡膠樹葉片CAT、SOD、POD、PAL和PPO活性均顯著高于其他處理組，各酶活峰值分別為4129.02、640.96、7416.94、173.35和71.59 U/g，為對照組的4.20、2.08、2.50、2.56和7.64倍。【結論】噴施生防菌Czk1稀釋液可促使橡膠樹抗病相關酶活性升高，誘導橡膠植株產生系統抗性。誘導抗性可能是枯草芽孢桿菌防治橡膠樹真菌病害的重要機制之一。

關鍵詞： 枯草芽孢桿菌；橡膠樹炭疽病；誘導抗病性；防御酶

中圖分類號： S435.76 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）04-0576-07

0 引言

【研究意義】天然橡膠（Hevea brasiliensis）是重要的工業原料，在我國云南、廣東及海南等地廣泛種植（祁棟靈等，2013）。長期以來，病蟲害問題是影響天然橡膠產量的重要因素之一，我國華南墾區橡膠樹上已發現40多種真菌病害（詹興球和蔡江文，2012），其中許多病害普查效率低，難以監測，采用化學方法防治成本高且防效差（李四有和邱學俊，2012）。生防枯草芽孢桿菌具有廣譜抗菌活性，在生物農藥的研發中應用廣泛，但其誘導橡膠樹產生抗病性的機理鮮見報道。因此，研究生防枯草芽孢桿菌對橡膠樹抗病相關酶系的影響，明確其誘導抗病性機理，可為橡膠樹真菌病害的綜合防控提供理論依據。【前人研究進展】植物誘導抗病性包括系統獲得抗病性（System acquired resistance， SAR）和誘導系統抗性（Induced systemic resistance， ISR），由生防拮抗菌引起的系統抗病性屬于ISR（陳志誼等，2001）。近年來，利用內生菌防治植物病害的研究已有廣泛報道（Tjamos et al.，2004）。內生細菌誘導植物產生ISR的機制包括誘導寄主細胞物理結構改變和產生生理生化反應變化兩方面，其中，生理生化反應變化主要是通過影響植物抗病相關酶的催化活動來實現，涉及的主要防御酶包括過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）等（范志金等，2005）。大量研究表明，生防菌可以誘導上述植物抗病相關防御酶產生變化，從而增強植物抗病能力（Chen et al.，2010），因此，有關芽孢桿菌誘導植物抗病性的研究日益增多（楊瑞先等，2012）。易龍等（2009）研究發現，芽孢桿菌Bn-130菌液可誘導辣椒體內POD、PPO和PAL活性增高。周林等（2011）采用灌根法接種枯草芽孢桿菌TR21發酵液、菌體及發酵上清液后，香蕉根系內POD、PPO和PAL活性均高于空白對照。林陳強等（2013）使用枯草芽孢桿菌CS16發酵液及上清液處理香蕉苗后，均能誘導香蕉葉片中SOD、PPO、PAL和POD等防御酶活性變化。張淑梅等（2014）研究表明，解淀粉芽孢桿菌TF28可誘導提高番茄葉片內防御酶活性，從而抵抗番茄灰霉病的侵染。【本研究切入點】橡膠樹病害拮抗枯草芽孢桿菌Czk1分離自橡膠樹木質部，室內平板對峙試驗結果表明Czk1菌株對13個橡膠樹根病菌和炭疽病菌具有強烈的拮抗作用，盆栽試驗表明其對橡膠樹炭疽病具有良好的生防效果（趙璐璐等，2011），但Czk1菌株的防病機理尚不明確。【擬解決的關鍵問題】通過測定接種菌株Czk1發酵液及接種橡膠樹炭疽病菌RC178處理的橡膠樹葉片中CAT、SOD、POD、PAL和PPO活性變化，明確菌株Czk1誘導植物獲得系統抗性情況，進一步豐富該菌株的拮抗機理，為其在生物防治領域的應用打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

拮抗細菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Czk1，分離自海南省屯昌縣中坤農場11隊染病橡膠樹樹根；橡膠樹炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporiodes）RC178分離自云南景洪縣勐養農場。以上菌株均由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所分離、鑒定與保存。供試橡膠種苗品種為熱研7-33-97。試驗用培養基為LB培養基及PDA培養基。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 Czk1發酵液制備及病原菌活化 挑取活化的Czk1單菌落于50 mL LB液體培養基中，于33 ℃下180 r/min搖床培養過夜，調節菌液濃度至108 CFU/mL作為1倍原液，用無菌水稀釋得到10倍稀釋液及100倍稀釋液。

將橡膠樹炭疽病菌RC178接種在PDA培養基上，28 ℃下培養5 d。

1. 2. 2 Czk1發酵液誘導處理 待橡膠苗長至35 cm左右時，選取長勢一致的健康植株布置盆栽試驗。分別取40 mL不同濃度（1、10和100倍）的Czk1菌液均勻噴灑植株葉面，以噴灑等量LB液體培養基為對照，每處理20株。

1. 2. 3 橡膠樹植株防御酶活性測定 分別于處理后24、48、72、96和120 h，按照酶活試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）步驟測定CAT、SOD、POD、PAL和PPO活性。取0.1 g橡膠樹葉片加入提取液在冰上研磨至勻漿，提取粗酶液，按照試劑盒步驟加入試劑。CAT活性測定240 nm處的初始吸光值和1 min后的吸光值；SOD活性測定560 nm處的吸光值；POD活性測定470 nm處30 s時的吸光值和1 min 30 s后的吸光值；PAL活性測定290 nm處的吸光值；PPO活性測定525 nm處的吸光值。根據試劑盒中公式計算各酶活性。

1. 2. 4 橡膠樹炭疽病菌及生防菌對橡膠植株抗性相關酶活性的影響 在橡膠苗嫩綠葉期，選擇長勢一致的健康植株布置盆栽試驗。試驗設4個處理，每處理20株。處理1，先接病原菌后噴施生防菌（R+C）：將炭疽病菌RC178菌餅（5 mm，下同）接在橡膠樹葉片上，每葉片接種4～6個菌餅，24 h后再噴施Czk1發酵液10倍稀釋液；處理2，先噴施生防菌后接病原菌（C+R）：每株橡膠苗均勻噴灑Czk1發酵液10倍稀釋液40 mL，24 h后接種RC178菌餅；處理3，病原菌處理（R）：將炭疽病菌RC178菌餅接種在橡膠樹葉片上，每葉片接種4～6個菌餅；處理4，空白對照（CK）：每株橡膠苗噴施40 mL LB液體培養基。

分別于處理后24、48、72、96和120 h測定葉片中CAT、SOD、POD、PAL和PPO活性，測定方法同1.2.3。

1. 3 統計分析

試驗所得數據用Excel 2007軟件整理，采用DPS 7.05統計軟件進行分析，用Tukey法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2. 1 拮抗菌Czk1對橡膠樹幼苗體內抗病相關酶活性的影響

2. 1. 1 CAT活性變化 由圖1可知，經Czk1發酵液誘導后，各濃度處理組CAT活性均高于對照，其中，10倍稀釋液及1倍原液處理組均表現為酶活性隨時間的增加先升高達到峰值后逐漸降低，且CAT酶活性分別在48和72 h達到峰值，活性為4264.62和3939.18 U/g，分別為對照的5.24和2.57倍，與對照間差異極顯著（P<0.01，下同）；而經100倍稀釋液處理后，橡膠葉片中CAT活性雖然略高于對照，但在72和96 h時與對照差異不顯著（P>0.05，下同），也沒有明顯的上升過程。

2. 1. 2 SOD活性變化 如圖2所示，經1倍原液及10倍和100倍稀釋液誘導的3個處理組SOD活性變化明顯，均表現為先升高后下降的變化趨勢，且在誘導后48 h到達峰值，在96 h下降至與對照接近的水平。其中，1倍原液、10倍稀釋液兩個處理組峰值時的酶活性分別為對照的5.19和5.03倍，分別達1344.53和1302.86 U/g，與對照間差異極顯著；100倍稀釋液處理組峰值時的酶活性僅為對照的2.34倍，與對照間差異顯著（P<0.05，下同）。

2. 1. 3 POD活性變化 由圖3可知，經10倍稀釋液處理后，橡膠樹葉片中POD活性在48～72 h時急劇上升，在72 h時達到峰值（28946.18 U/g），為對照的6.34倍，與對照間差異極顯著，隨后酶活性緩慢下降；經1倍原液及100倍稀釋液誘導后，兩個處理組的POD活性先緩慢上升，在96 h達到峰值后下降，峰值分別為對照的3.17和2.10倍，分別與對照間達到極顯著和顯著差異水平。比較3個處理組POD活性變化，結果發現，10倍稀釋液處理組的酶活性顯著高于其他兩個處理組，誘導效果最佳。

2. 1. 4 PAL活性變化 由圖4可知，經10倍稀釋液誘導的處理組PAL活性在24～72 h內逐漸增高，72 h活性達到峰值（186.67 U/g），為對照的3.19倍，與對照間差異極顯著，隨后開始下降；經1倍原液誘導的處理組，PAL活性在48 h出現短暫降低后持續增高，在第96 h時達到峰值，峰值為對照的1.91倍，與對照間差異顯著；100倍稀釋液處理組與對照相比各時間點酶活性均無顯著差異，也無明顯峰值出現，表明100倍稀釋液可能不能誘導橡膠葉片PAL活性增高。

2. 1. 5 PPO活性變化 由圖5可知，經10倍稀釋液誘導的處理組，橡膠葉片PPO活性呈先增高后降低的趨勢，在48 h達到峰值（53.70 U/g），為對照的3.38倍，與對照間差異極顯著，誘導效果最佳；經100倍稀釋液誘導的處理組，PPO活性也在48 h達到峰值，但與對照間差異不顯著，峰值為對照的1.60倍，而后緩慢降低至與對照接近的水平；經1倍原液誘導的處理組，PPO活性在處理后24 h即達到較高水平，且高于其他兩個處理組，但在隨后的時間內沒有發生明顯變化，PPO活性在30.00 U/g上下波動，沒有出現明顯峰值，誘導效果與10倍液處理組有明顯差別。

2. 2 橡膠樹炭疽病菌RC178及拮抗菌Czk1對橡膠植株抗性相關酶活性的影響

2. 2. 1 橡膠樹葉片CAT活性變化 測定生防菌及病原菌共同處理后橡膠葉片中抗性防御酶CAT活性，結果見圖6。3個處理組CAT活性均高于空白對照，其中，先接種生防菌Czk1再接種病原菌RC178的處理組的CAT活性與其他各處理間差異達極顯著水平，其在24～72 h時酶活性不斷上升，在72 h時酶活性達到峰值（4129.02 U/g），為對照的4.20倍，隨后酶活性逐漸降低；先接種病原菌再接種生防菌后，橡膠葉片CAT酶活性在48 h時達到峰值（2223.84 U/g），為對照的3.12倍，與對照間差異極顯著，但在72～120 h時降低至與對照接近的水平；只接種病原菌后，橡膠樹葉片CAT活性在各時間段均在1000.00 U/g上下波動，沒有明顯的活性峰，CAT活性雖然高于對照，但在72 h時與對照差異不顯著。

2. 2. 2 橡膠樹葉片SOD活性變化 由圖7可知，3個處理組SOD活性均高于空白對照，均呈先增高后降低的趨勢，且均在72 h達到峰值，其中，先接生防菌再接病原菌的處理組SOD活性峰值最高，達640.96 U/g，為對照的2.08倍，與對照間差異極顯著；先接病原菌再接生防菌的處理組SOD活性峰值為515.18 U/g，是對照的1.67倍，與對照間差異顯著；只接種病原菌的處理組SOD活性峰值為392.04 U/g，僅為對照的1.27倍，與對照間差異不顯著。

2. 2. 3 橡膠樹葉片POD活性變化 由圖8可知，先接種病原菌的處理組POD活性在48～72 h內與對照差異顯著；只接病原菌的處理組POD活性變化平緩均在3500.00 U/g上下波動，在24和48 h時與對照差異不顯著，在72～120 h時差異顯著；而先接種生防菌再接種病原菌的處理組POD活性變化明顯，在24～72 h內不斷增加，在72 h時達到峰值（7416.94 U/g），為對照的2.50倍，且與其他各處理組間差異達極顯著水平。

2. 2. 4 橡膠樹葉片PAL活性變化 由圖9可知，經生防菌和病原菌共同誘導的2個處理組PAL活性均高于其他處理組，酶活性變化表現為先增高再降低的趨勢，且均在72 h達到峰值，其中先接種生防菌的處理組PAL活性峰值最高，達173.35 U/g，為對照的2.56倍，與對照間差異極顯著；先接種病原菌的處理組PAL活性峰值為130.62 U/g，為對照的1.93倍，與對照間差異顯著；只接種病原菌的處理組PAL活性在48～120 h內與對照間差異不顯著。

2. 2. 5 橡膠樹葉片PPO活性變化 由圖10可知，處理后48 h，先接種病原菌再接種生防菌的處理組PPO活性最先升高達到峰值（52.80 U/g），為對照的4.47倍，與對照間差異極顯著，隨后酶活逐漸降低；先接種生防菌再接種病原菌的處理組PPO活性在72 h到達峰值（71.59 U/g），高于所有處理組，為對照的7.64倍，與對照間差異極顯著；只接種病原菌的處理組PPO活性略高于對照，在48和96 h時與對照差異顯著，其他時間段內均與對照間差異不顯著，其酶活性隨時間變化平緩，沒有出現明顯的活性峰。

3 討論

當植物受病原菌侵染或誘導處理后，與抗病反應相關的保護性酶活性升高是誘導抗性產生的重要機制之一，其中CAT、SOD、POD、PAL和PPO是植物體內與抵制病原微生物侵染有關的重要酶，其活性的變化通常作為衡量植物體內防衛反應的重要指標（Ehret et al.，2010）。

CAT作為生物防御體系的關鍵酶之一，是重要的活性氧清除劑，可以清除植物體內的過氧化氫（張先成等，2009）。本研究中，枯草芽孢桿菌Czk1發酵液10倍稀釋液處理后橡膠葉片CAT活性更早達到峰值（4264.62 U/g）。先接種生防菌再接種病原菌后，橡膠樹葉片CAT活性顯著高于其他處理組，與彭燦（2013）的研究結果一致。

SOD也是主要的活性氧清除酶，能夠避免活性氧在植物體內大量產生和積累（龐學群等，2008）。本研究結果顯示，經枯草芽孢桿菌Czk1發酵液10倍稀釋液處理48 h后，橡膠樹幼苗體內SOD活性達到峰值，為1302.86 U/g。在接種枯草芽孢桿菌Czk1和橡膠炭疽菌RC178后，各處理以先接生防菌再接病原菌的處理組SOD活性峰值最高，與陳志誼等（2001）將水稻接種拮抗菌B-916與水稻紋枯病菌后SOD活性無明顯變化的研究結果不同，可能是炭疽病菌RC178的侵染使得橡膠植株中活性氧含量升高所致。

POD屬于PR-9蛋白家族，可催化形成木質素，加固植物細胞壁，從而抵抗病原物的入侵，同時也能清除細胞內的活性氧（林陳強等，2013）。本研究中經枯草芽孢桿菌Czk1發酵液10倍稀釋液處理的橡膠植株，葉片中POD活性顯著高于其他濃度處理，峰值達到28946.18 U/g，與傅瑩等（2011）的研究結果相似，說明提高菌液濃度并不一定能誘導植株防御酶活性升高，拮抗菌液濃度與誘導植物產生抗性的效果并非正相關。同時，先接種生防菌Czk1再接種病原菌，橡膠樹葉片中POD活性顯著高于其他處理組，說明在病菌侵染植株之前接種生防菌有利于誘導抗病性。

PAL是苯丙烷類代謝中的關鍵酶，植物在受到病原菌侵染或激發子刺激后，PAL活性首先上升（王淑霞等，2013）。本研究結果顯示，枯草芽孢桿菌Czk1發酵液10倍稀釋液能夠更快地誘導橡膠植株葉片內PAL活性增高，提高抗病性；先接種生防菌再接種病原菌的處理PAL活性最高，誘導效果最好。周林等（2011）使用灌根法將枯草芽孢桿菌TR21發酵液接種到香蕉植株后，香蕉根系PAL活性出現兩次高峰且始終保持在較高水平，與本研究中PAL活性只出現一次高峰不同，究其原因可能是不同接種方法對PAL活性影響不同。

PPO一方面能催化產生木質素和酚類氧化產物，構成保護性屏障，抵抗病原菌的入侵，另一方面能催化酚類物質氧化形成高毒性的醌類物質，直接作用于病原菌（劉淑宇等，2013）。本研究中，經Czk1發酵液10倍稀釋液處理的橡膠植株，其葉片內PPO活性顯著高于其他濃度處理，峰值達53.70 U/g。陳志誼等（2001）將拮抗菌B-916與紋枯病菌RH-2接種于水稻植株，研究水稻組織中PPO活性變化，結果發現，只接種病原菌的處理組PPO活性最先達到峰值，且峰值高于其他各處理組；本研究中只接種病原菌的處理橡膠葉片中PPO活性首先達到峰值（52.80 U/g），與陳志誼等（2001）的研究結果相似，但先接種生防菌再接種病原菌的處理組PPO活性最高，與陳志誼等（2001）的研究結果不同，說明拮抗菌Czk1與拮抗菌B-916相比，能夠更好地誘導植株PPO活性增高，增強植株抵御病原菌的能力。

在本研究中，生防菌Czk1發酵液可影響橡膠樹葉片中CAT、SOD、POD、PAL和PPO活性變化，誘導橡膠苗產生系統抗性，但對其發酵液在田間的防病效果還有待評價。因此，后續的研究有必要通過大田試驗以明確其抗病潛能，驗證其抗性誘導機理，為實現該菌株的開發應用提供技術支持。

4 結論

本研究結果表明，拮抗細菌Czk1可誘導橡膠植株抗性相關防御酶的變化，拮抗菌液濃度與誘導植物產生抗性的效果并非正相關，其中10倍稀釋液誘導效果最佳；在植株受到病原菌侵染前噴灑Czk1發酵液，對橡膠苗葉片內防御酶活性影響最大，更有利于誘導抗病性。因此，誘導抗性可能是枯草芽孢桿菌防治橡膠樹真菌病害的重要機制之一。

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（責任編輯 麻小燕）