我國甘蔗銹病病原菌及甘蔗品系抗褐銹病基因Bru1的分子檢測

傅華英 肖勝華 劉營航 孫生仁 吳小斌 陳如凱 高三基

摘 要 為了解我國甘蔗銹病病原菌發生以及優良甘蔗新品種（系）抗褐銹病基因Bru1的分布頻率情況，以來自我國5?。▍^）81份疑似甘蔗銹病葉片樣品為材料，分別用Pm1-F/Pm1-R和Pk1-F/Pk1-R引物對進行褐銹病菌（Puccinia melanocephala）與黃銹病菌（Puccinia kuehnii）分子鑒定。結果表明，銹病病原菌檢出率為40.7%，除了福建省福州市葉片樣品僅檢測到P. melanocephala外，其他?。▍^）的葉片樣品均檢測到2種銹病病原菌，且存在混合侵染現象。對24份黃銹病菌陽性PCR產物（527 bp）克隆并測序，結果發現P. kuehnii間隔區1（ITS1）第183個核苷酸存在單核苷酸多態性（SNP），其中，A堿基（183A）、G堿基（183G）位點的病菌分離物分別占29.2%和25.0%，2種堿基（183A/G）位點的混合病菌分離物有45.8%。通過R12H16與9020-F4/RsaI兩種分子標記對40份甘蔗新品種（系）抗褐銹病基因Bru1進行分子檢測，結果表明，42.5%參試新品種（系）含抗褐銹病基因Bru1，這些材料可作為甘蔗抗褐銹病新品種加以推廣應用。

關鍵詞 甘蔗銹病；病原菌；新品種（系）；抗褐銹病基因Bru1；分子檢測

中圖分類號 S435.661 文獻標識碼 A

Abstract The aim of this study was to investigate the incidence of causal pathogens causing sugarcane rust and frequency of Bru1 gene in new elite sugarcane clones. Two sets of primers of Pm1-F/Pm1-R and Pk1-F/Pk1-R were used for the identification of Puccinia melanocephala and Puccinia kuehnii respectively， causing the sugarcane rust in 81 leaf samples collected from five provinces in China. PCR assay revealed 40.7% of samples were verified to infect with P. melanocephala or/and P. kuehnii. Co-infection with two causal fungi was observed in leaf samples from most of provinces except for Fuzhou， Fujian. Subsequently， PCR products from 24 leaf samples infected with P. kuehnii were cloned and then sequenced to analyze the SNP（Single Nucleotide Polymorphism）in P. kuehnii ITS1 183A/G locus. Results showed that allele 183A and 183G were observed in 29.2% and 25.0% causal isolates， respectively， whereas 183A/G was detected in 45.8% causal isolates. Two marker-assisted R12H16 and 9020-F4/RsaI were used for screening of Bru1 resistance gene for brown rust in 40 new elite sugarcane clones. Bru1 frequency was 42.5% in the tested clones， of which would be applied in the effective and durable resistance in sugarcane against the P. kuehnii.

Key words Sugarcane rust； Pathogenic bacteria； New varieties（or lines）； Bru1（brown rust resistance genes）； Molecular detection

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.017

甘蔗銹病是一種重要的世界流行的甘蔗真菌性病害，分為褐銹?。˙rown rust）和黃銹?。∣range rust）2種類型，其病原菌分別為擔子菌綱柄銹科（Pucciniaceae）柄銹菌屬（Puccinia）的黑頂柄銹菌Puccinia melanocephala H. & P. Syd. 和屈恩柄銹菌Puccinia kuehnii Butler[1]。甘蔗褐銹病分布廣泛、為害較大，在多數種植甘蔗的國家或地區均有發生，可以引起感病品種產量損失10%～40%；甘蔗黃銹病主要分布于亞洲和澳大利亞，近年來已擴散到美國的弗羅里達州以及墨西哥、巴西等西半球國家或地區，在非洲國家目前還未有黃銹病發生的報道[1-2]。

甘蔗褐銹病與黃銹病可以通過田間甘蔗感病癥狀及夏孢子的顏色和形態加以區別。然而，夏孢子形態特征上的差異細微，且僅當孢子堆完全成熟時才可通過高倍顯微鏡鑒別，受到繁殖季節、病原保存、儀器設備等諸多因素的限制。利用分子生物檢測手段來區別這2種病原菌已有報道。Glynn等[2]針對P. melanocephala和P. kuehnii這2種病原菌分別設計了特異性常規PCR和實時熒光PCR引物及探針；此外，利用PIRA-PCR（Primer-introduced restriction analysis PCR）技術檢測分析P. kuehnii病菌，發現PkPmF/PkPmR引物擴增的PCR產物（606 bp）第183個核苷酸存在SNP（Single Nucleotide Polymorphism）位點，為A或G堿基[2]。

甘蔗銹病的流行與品種抗病性密切相關，抗性品種的選育和推廣已成為控制褐銹病爆發流行最經濟有效的措施[3]。因此，對已有的優良甘蔗新品種（系）進行抗褐銹病篩選成為選育高抗甘蔗品種的關鍵。然而，抗甘蔗褐銹病品種的篩選與鑒定主要使用人工接種表型觀察選擇，該傳統方法低效、費時，且由于環境條件、病原活力以及接種壓力的影響，鑒定結果容易出現誤差[4]。為此，國內外甘蔗分子遺傳學家試圖尋找與抗銹病相關的分子標記。Daugrois等[5]發現了抗褐銹病主效基因Bru1；Costet等[6]研發出9020-F4/RsaI和R12H16 兩個針對抗褐銹病基因Bru1的PCR分子標記，之后，許多國內外研究結果證實抗褐銹病基因Bru1與甘蔗抗P. melanocephala能力緊密相關[7-8]。早有報道，我國甘蔗銹病致病菌有P. melanocephala和P. kuehnii[9]。本研究擬了解這2種病原菌在我國主要蔗區的發生情況以及優良甘蔗新品種（系）抗褐銹病基因Bru1的分布狀況，為及時有效開展甘蔗銹病病原檢測和優良甘蔗新品種（系）的篩選提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2013～2014年，從云南、廣東、廣西、四川、福建等省（區）的40個甘蔗新品種（系）采集的疑似甘蔗銹病癥狀葉片樣品81份（表1），-80 ℃冰箱保存備用。

dNTPs、Ex Taq酶、限制性內切酶RsaI、pMD19-T載體購自TaKaRa（上海）公司；DNA Marker、大腸桿菌宿主菌DH5α感受態細胞、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 用于檢測褐銹病引物Pm1-F/Pm1-R和檢測黃銹病引物Pk1-F/Pk1-R的序列參照文獻[2]，甘蔗抗褐銹病基因Bru1的兩種分子標記R12H16和9020-F4引物序列參照文獻[6]（表2）。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.2 DNA提取及銹病PCR檢測 甘蔗葉片總DNA提取參考CTAB法完成。DNA的質量和數量分析分別通過瓊脂糖凝膠電泳檢測和Naro Drop微量核酸測定儀完成，所有DNA保存于-20 ℃備用。PCR反應體系及反應條件參照文獻[2]。總體積均為25 μL，包括1.0 μL DNA（約100 ng）為模板，1.0 U Ex Taq DNA聚合酶，2.5 μL 10×Ex Taq buffer，0.25 μmol/L上下游引物Pm1-F/Pm1-R或Pk1-F/Pk1-R和0.2 mmol/L dNTPs。反應條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環；72 ℃延伸7 min。

1.2.3 甘蔗抗褐銹病基因Bru1的分子檢測 甘蔗抗褐銹病基因Bru1分子標記R12H16和9020-F4的PCR反應體系及反應條件參照文獻[6]?？傮w積均為25 μL，包括1.0 μL DNA（約100 ng）為模板，1.0 U Ex Taq DNA聚合酶，2.5 μL 10×Ex Taq buffer，0.25 μmol/L上下游引物R12H16-F/R12H16-R或9020-F4-F/ 9020-F4-R和0.2 mmol/L dNTPs。PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。

R12H16分子標記PCR擴增產物直接用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測；9020-F4/RasI分子標記PCR擴增產物通過限制性內切酶RsaI 酶切檢測，并根據限制性內切酶多態性判別。酶切體系總體積25 μL，含有純化后的PCR產物15.0 μL、10×NEB 緩沖液2.5 μL、RsaI酶（10 000 U）1.0 μL、無菌水 6.5 μL，酶切反應程序為37 ℃ 2 h，然后65 ℃ 10 min。取酶切產物10 μL，用3%低熔點瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 PCR產物純化和克隆 PCR反應結束后取5 μL反應產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR產物經純化后克隆至pMD19-T載體，并轉化至DH5α感受態細胞中，取100 μL涂于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養基平板上，37 ℃暗培養16～18 h，挑取若干個單菌落分別接種到含氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養4 h，經菌液PCR篩選得到陽性克隆，隨機挑選3個陽性克隆子送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.5 序列分析 PCR產物目的片段克隆和測序后，序列提交GenBank數據庫在線blast分析（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），驗證序列是否正確。

2 結果與分析

2.1 甘蔗銹病病原菌PCR鑒定

在我國主要蔗區采集的81份甘蔗葉片樣品中共檢測得到33份陽性樣品，銹病病原菌的陽性檢出率為40.7%。其中17份樣品PCR擴增出現P. melanocephala目的片段，大小約480 bp，24份樣品PCR擴增出現P. kuehnii目的片段，大小約527 bp，8份樣品PCR擴增同時出現P. melanocephala和P. kuehnii目的片段（圖1）。所有陽性樣品目的片段序列提交GenBank數據庫在線Blast分析，證實為褐銹或黃銹病菌ITS序列，包括ITS1區（位于18S與5.8S rDNA之間）、ITS2區（位于5.8S與28S rDNA之間）的一部分序列和5.8S rDNA的全部序列。

2.2 甘蔗銹病病菌分布

根據甘蔗銹病樣品的地理來源，對我國主要蔗區銹病病原菌檢出率和地理分布進行統計（表3），結果顯示，除了福建省福州甘蔗樣品僅檢測到褐銹病病菌外，其他省（區）廣東、廣西、云南、四川甘蔗樣品均檢測到2種銹病病原菌，其中廣東、廣西、四川樣品存在混合侵染現象。在33份陽性樣品中，P. melanocephala和P. Kuehnii單獨侵染樣品檢出率分別為11.1%和19.8%，2種病原菌混合侵染樣品檢出率為9.8%。

2.3 甘蔗黃銹病菌的SNP多態性

已有報道PkPmF/PkPmR引物擴增的PCR產物（606 bp）第183個核苷酸存在SNP位點，為A或G堿基[2]。為此，對本實驗檢測為陽性的24份黃銹病樣品的PCR產物進行克隆并測序。序列分析發現24份樣品PCR產物中第183個核苷酸為A堿基（183A）有29.2%，為G堿基（183G）有25.0%，而存在2種堿基（183A/G）有45.8%（圖2）。同一PCR產物同時存在183A或183G，可能由于2種類型的P. kuehnii病菌分離物同時侵染同一甘蔗品種（系）所致。

2.4 優良甘蔗新品種（系）抗褐銹病基因Bru1的分子檢測

以我國各育種單位選育的40份甘蔗品種（系）的DNA為模板，抗褐銹病基因Bru1分子標記R12H16-F/R12H16-R特異性引物檢測結果表明，有17個甘蔗品種（系）含有該基因（圖3-A），陽性檢出率為42.5%；以另一對分子標記特異性引物9020-F4-F/9020-F4-R進行PCR檢測，結合RsaI限制性內切酶多態性分析，含有該基因的甘蔗品種（系）陽性樣品含有一條200 bp大小的特異性條帶（圖3-B），其檢出率與R12H16-F/R12H16-R分子標記檢測結果一致。

3 討論

我國蔗區銹病的發生以褐銹病為主，黃銹病是在上世紀80年代底在福建等蔗區發現[9]。在云南西南濕熱蔗區發現蔗茅柄銹菌（Puccinia erianthi Padw et Khan）引起了銹病[10-11]，但后來國外學者認為蔗茅柄銹菌與黑頂柄銹菌屬于引起甘蔗褐銹病的同種病原菌[12-13]。本研究從我國5個?。▍^）蔗區采集了81份疑似銹病的甘蔗葉片樣品，檢測結果發現除了福建福州葉片樣品沒有檢測到黃銹病菌，其他省份蔗區葉片樣品均檢測到黃銹病菌和褐銹病菌，且存在混合侵染現象。福州蔗區沒有檢測到黃銹病菌，可能由于采集樣品太少所致。

為了進一步分析P. kuehnii病菌是否存在SNP位點，在Pk1-F/Pk1-R引物檢測P. kuehnii為陽性的24份葉片樣品中，從它們的PCR產物克隆和測序分析得知目的片段第183個核苷酸存在SNP，183A、183G位點出現頻率分別為29.2%、25.0%，而同時存在2種類型183A/G的頻率為45.8%。同一葉片樣品存在2種類型P. kuehnii病菌分離物混合侵染，已排除因為PCR擴增、測序引起的誤差。Glynn等[2]利用PIRA-PCR方法檢測來自各國甘蔗銹病葉片樣品P. kuehnii病菌SNP，結果發現來自中國、澳大利亞的樣品P. kuehnii病菌存在183A或183G位點，而來自加勒比海盆地國家的樣品發現只有183A位點。同時，Glynn等[2]也對PkPmF/PkPmR引物擴增的PCR產物直接測序，發現183A/183G等位位點頻率與PIRA-PCR方法檢測結果略有差異，這可能由于P. kuehnii病菌分離物183A/183G附近存在額外的差異堿基，導致PIRA-PCR方法無法檢測到這2種等位位點。

選育和推廣抗病品種是病害防治的最經濟、最有效的方法。甘蔗為異源多倍體無性繁殖作物，基因型受環境條件影響較大，育種年限較長，選育出1個優良品種至少需要8～10年。隨著分子標記技術的發展，利用與抗病基因緊密連鎖的分子標記可以作為甘蔗抗病分子育種重要的輔助手段。Daugrois[5]和Asnaghi[14]等分別在栽培品種R570上發現和定位甘蔗抗褐銹病主效基因Bru1，隨后，Costet等[6]開發出2種與該基因密切相關的R12H16和9020-F4/RsaI分子標記，研究發現在來自全球各蔗區的194份抗褐銹病材料中，有86%存在抗褐銹病基因Bru1，而感病材料均不含該基因。之后，許多學者將這2個分子標記應用于甘蔗品種及種質資源[15]、雜交親本及其后代[4，7]、野生種質資源[8]抗褐銹病材料的發掘、篩選和評價，認為這些含有抗褐銹病基因Bru1的材料是選育抗褐銹病甘蔗品種很有利用前景的抗源種質。本研究也利用R12H16和9020-F4/RsaI分子標記對40個供試品種（系）開展了抗褐銹病篩選，發現42.5%的品種（系）含有抗褐銹病基因Bru1，有意思的是，本實驗中含有抗褐銹病基因Bru1的品種（系）均未檢測到P. melanocephala，然而這些供試材料的抗病性等級需要進一步通過孢子懸浮液人工接種驗證。

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