降香黃檀、檀香根際解鉀菌的篩選與活性研究

羅娜 周德明 徐睿 周國英

摘 要 為提高降香黃檀-檀香人工林的土壤肥力，從不同林齡的降香黃檀、檀香根際土壤中分離篩選高效解鉀菌。從鉀細菌富集培養基上初篩和解鉀菌篩選培養基復篩得到可培養物89個。采用原子吸收分光光度法測定菌株解鉀能力。結果表明，可溶性鉀含量在70 μg/mL以上的菌株有6株，其中菌株JT-K21、JT-K11和JT-K18的解鉀率為80%以上。JT-K21培養液的可溶性鉀含量高達132.68 μg/mL，解鉀率達到221.18%。基于形態學、生理生化特性及16S rDNA序列比較分析，初步鑒定JT-K21為惡臭假單胞菌Pseudomonas putida。不同碳氮源試驗表明：JT-K21對蔗糖和硫酸銨的吸收效果最好。通過單因素試驗及正交試驗結果表明：菌株JT-K21液體發酵菌體濃度最大培養組最優組分為蔗糖（10 g/L）、硫酸銨（0.2 g/L）、氯化鈉（0.1 g/L）、鉀長石（5 g/L）；JT-K21液體發酵解鉀活性最佳時，培養基最優組分為蔗糖（10 g/L）、硫酸銨（0.2 g/L）、氯化鈉（0.1 g/L）、鉀長石（3 g/L）。

關鍵詞 降香黃檀；檀香；解鉀菌

中圖分類號 S792.28；S182 文獻標識碼 A

Abstract To improve the soil fertility of the mixed forests Dalbergia Odorifera and Santalum album L.， the high efficiency potassium utilization bacteria were isolated and screened from the rhizosphere soil of different ages of D. Odorifera and S. album L.. By potassium bacteria culture medium and potassium-releasing bacteria culture medium， 89 bacteria strains were obtained and cultivated. The ability of dissolving potassium of the 89 isolates were determined with the atomic absorption spectrophotometer method. As the results showed that six bacteria strains had the content of soluble potassium more than 70 μg/mL. Among them， the strains JT-K21， JT-K11 and JT-K18 were of the potassium solvability above 80%. The culture medium of JT-K21 with the soluble potassium content reached 132.68 μg/mL， potassium solvability reached 221.18%. Based on morphology， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis， strains JT-K21 was preliminarily identified as Pseudomonas putida. As the result of carbon and nitrogen source test showed that： strains of JT-K21 had the best absorptive effect on sucrose and ammonium sulfate. By single factor and orthogonal test， when JT-K21 liquid fermentation cell concentration reached the maximum， the optimal culture medium component was sucrose（10 g/L）， ammonium sulfate（0.2 g/L）， sodium chloride（0.1 g/L）， feldspar（5 g/L）. When JT-K21 liquid fermentation dissolved potassium activity reached the highest， the optimal culture medium component was sucrose（10 g/L）， ammonium sulfate（0.2 g/L）， sodium chloride （0.1 g/L）， feldspar（3 g/L）.

Key words Dalbergia Odorifera；Santalum album L.；Potassium releasing bacteria

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.018

解鉀菌稱硅酸鹽細菌（Silicate bacteria），能有效分解含鉀礦物，利用磷、鉀等礦物元素；主要有土壤芽胞桿菌（Bacillus edaphicus）、環狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）和膠質芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）等[1]。鉀是作物營養的三要素之一，在植物生長發育的過程中，參與了60種以上酶系統的活化、光合作用以及同化產物的運輸、碳水化合物的代謝和蛋白質的合成等過程，同時還能增強作物的抗病蟲害、抗倒伏、抗旱和抗寒等抗逆能力。中國土壤中可溶性鉀資源匱乏，但是以鉀長石為主的難溶性硅鋁酸鉀資源存儲豐富，分布廣泛，南方儲存尤為豐富[2]。化學肥料雖然見效快、投入小，但易造成土壤結構破壞、有機質含量下降[3]，且污染環境。近年來發現，根際解鉀微生物與普通解鉀菌相比，它不僅能轉化土壤難溶性鉀、改造土壤結晶構造[4]；還能分泌促生物質，活化植物根際土壤微生態環境，促進植物生長[5]。Sugumaran等[6]從土壤中篩選得到一株解鉀菌，其解鉀能力達 4.29 mg/L，將其施用于土壤中，使得土壤可溶性鉀上升至99.60 mg/kg，植物干重增大125%，有機質增加35.41%。通過從特定植物根際分離篩選出高效解鉀菌，對于發展現代生態農業具有十分重要的意義。

降香黃檀（Dalbergia odorifera），別名黃花梨，商品名Scentedroswood（香紅木），是原產于中國海南的一種豆科蝶形花亞科的常綠喬木，國家二級重點保護野生瀕危樹種，珍稀的紅木樹種，廣泛分布于中國海南、廣東等地及東南亞地區。因其生長緩慢、極難成材，是高檔家具、香料的重要原料及名貴的藥材來源，現已瀕臨滅絕。多年來中國林業部門在研究“降香黃檀”的育苗工作中曾投入了大量的人力、物力、財力，但成活率較低[7-8]。檀香（Santalum album Linn.）為半寄生樹種，其根部的木質部能長出新組織進入被寄主植物的木質部形成吸盤，進行水分和養分交換。無寄主的情況下幼年期的檀香可存活1 a左右，甚至生活更久，但通常有寄主的檀香會生長更好[9-11]。野生的降香黃檀、檀香多生長在較貧瘠的土壤環境中，人工移植后抗逆能力較差，為加快降香黃檀、檀香產業發展，縮短人工培育周期，增強植株抗逆能力，顯得尤為迫切。本研究從降香黃檀、檀香原產地海南降香黃檀、檀香主要種植區的土壤中分離篩選高效解鉀菌，并對其進行鑒定，同時對菌株的發酵條件進行了優化，為研制降香黃檀、檀香專用生物肥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 土壤樣品采自海南省降香黃檀、檀香主要種植區，利用五點隨機采樣法。用小鏟除掉表層土，取4、5、6、7、10年生的降香黃檀、檀香根際土壤（20～40 cm）。分別裝入保鮮袋（無菌）中，貼上標簽，4 ℃保存帶回實驗室分離。

1.1.2 供試培養基 （1）鉀細菌富集培養基：葡萄糖10 g/L，CaCO3 5.0 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaSO4.2H2O 0.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，瓊脂18 g/L，去離子水，pH7.2。

（2）鉀細菌篩選培養基：葡萄糖10 g/L，CaCO3 5.0 g/L，Na2HPO4 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，CaSO4·2H2O 0.2 g/L，鉀長石（K2O·Al2O3·6SiO2）粉（150 目） 2.5 g/L，瓊脂18 g/L，去離子水，pH7.2。

（3）LB培養基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂18 g/L，去離子水，pH7.2[12]。

1.2 方法

1.2.1 根際高效解鉀菌分離 分別稱取不同土樣10 g，置入裝有90 mL0.85%NaCl溶液的150 mL三角瓶中，轉速160 r/min，振蕩20 min后，制成均勻的土壤懸液。用10倍稀釋法依次配制10-1～10-6的濃度梯度樣液，取10-4、10-5、10-6 3個濃度梯度的樣液，用于分離解鉀菌。每次每個濃度樣液吸取100 μL，涂布于鉀細菌富集培養基上，3次重復，28 ℃培養2 d左右。挑取圓形、透明、表面濕潤黏稠的大型菌落，進行平板劃線純化，反復進行 3次，同時用顯微鏡觀察菌落純度，直至獲得純培養，用LB斜面培養基4 ℃保存并做好標記。

解鉀菌的復篩搖瓶培養： 將種子液按5% 接種量接種到50 mL/250 mL解鉀復篩培養基，30 ℃ 180 r/min搖床培養7 d。設加等量滅活種子液的對照處理，每個處理3個重復。再用解鉀菌篩選培養基進行復篩，進一步分離純化解鉀菌，挑選出長勢較好的單菌落，進行保存并做好標記。

1.2.2 菌株解鉀能力測定 將已滅菌的50 mL 解鉀液體培養基及2 mL菌懸液（108 cfu/mL）加入300 mL 三角瓶中，160 r/min，30 ℃培養5 d，并設置不接菌液的空白對照組。培養液經1 000 r/min、4 ℃離心5 min，吸取4 mL上清液與4 mL 6 mmoL/L的LiCl充分混勻，采用原子吸收分光光度法測定待測菌株及空白組培養液的可溶性鉀含量[13]。

1.2.3 菌株鑒定 （1）菌株形態觀察：記錄待鑒定菌株在鉀細菌富集固體培養基上培養2 d的菌落特征，并觀察其菌體形態特征。

（2）生理生化特征：參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第八版）及《常見細菌系統鑒定手冊》[14]，進行細菌生理生化試驗。

（3）16S rRNA 序列測定及分析：以待測細菌菌株基因組DNA為模板，選用細菌16S rRNA基因通用引物27F和1 492R，進行PCR擴增。PCR反應條件：94 ℃ 5 min， 94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環30個，72 ℃10 min。將所得產物樣品送至上海博尚生物技術公司測序，測序結果在NCBI中進行BLAST分析，利用EGA5.05軟件，使用Neighbor-Joining法進行計算分析（Bootstraps=1 000），構建菌株系統進化樹[15]。

1.2.4 功能菌株生長曲線測定 按5%的接種量將JT-K21菌液加入到解鉀菌發酵培養基中，其中裝液量為100 mL/250 mL，保證菌液濃度為108 cfu/mL。在160 r/min 30 ℃培養48 h，間隔4 h取樣一次，測定培養樣液的OD值。

1.2.5 不同碳氮源對菌株活性的影響 采用試驗效果最佳的菌群組合，研究不同碳氮源對菌株活性的影響（增設對照組）。選取不同碳氮源進行液體培養實驗，其中不同碳源為葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉及甘露糖，不同氮源為酵母膏、氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉、蛋白胨。用原子分光光度法測定解鉀菌培養液的可溶性鉀含量，并測定菌體濃度OD值。

1.2.6 培養基正交試驗 以上述碳氮源實驗為基礎，設計4因素3水平的正交試驗。將解鉀菌接種于裝有已滅菌的100 mL解鉀菌液體發酵培養基中，30 ℃ 160 r/min培養4 d。可溶性鉀含量用原子分光光度法測定，同時測定菌體濃度OD值，以確定最優培養基成分配比。

1.3 數據分析

采用SPSS 19.0軟件對實驗結果進行方差分析和多重比較（LSD法和Duncan檢驗）等，并用Excel 2010制作圖表。

2 結果與分析

2.1 根際高效解鉀細菌的分離、篩選

2.1.1 解鉀菌的分離純化 不同林齡（3、4、5、6、7、10年）的降香黃檀、檀香根際土壤，共純化出可培養物89個。菌落呈近圓形或橢圓形、白色或灰白色、半透明或不透明、大部分邊緣規則、生長速度中等。

2.1.2 菌株解鉀能力測定 由表1可知，對照組的可溶性鉀含量為41.31 μg/mL。可溶性鉀含量在70 μg/mL以上的菌株有6株，解鉀率在80%以上的菌株有3株，分別為菌株JT-K21、JT-K11及JT-K18，其中JT-K21培養液的可溶性鉀含量最高，高達132.68 μg/mL，解鉀率為221.18%。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態學觀察 在鉀細菌富集固體培養基上培養2 d，菌株JT-K21的菌落呈淡白色，不透明，表面光滑，扁平，邊緣模糊，生長較快。JT-K21革蘭氏染色均呈陰性，無芽孢，桿狀，單個或成對排列，大小為（1.4～2.1）μm×（0.6～0.8）μm（圖1～2）。

2.2.2 菌株生理生化 JT-K21具有運動性，可利用葡萄糖、蔗糖，過氧化氫反應、硫化氫試驗、檸檬酸鹽試驗呈陽性，可水解明膠、淀粉，還原硝酸鹽，其余生理生化測定指標見表2。結合形態學特征和生理生化指標，初步判斷JT-K21屬于假單胞菌科，假單胞菌屬。

2.2.3 16S rRNA基因序列測定及分析 測序所得的功能菌株16S rDNA序列長度均在1 500 bp左右，將各菌株序列在NCBI中進行BLAST同源性比較，同時與GenBank中的核酸數據進行對比分析，其中JT-K21與Pseudomonas putida（KF 831377）的同源性均達99%。篩選出有較高同源性的代表菌株，以各根際土壤功能菌的16S rRNA序列為基礎，構建各自的系統進化樹。JT-K21與假單胞菌屬聚在同一族群，與Pseudomonas putida的遺傳進化距離最近（圖3）。綜合各菌株的形態學特征、生理生化特性及16S rRNA序列分析結果，初步鑒定菌株JT-K21為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）。同時在GenBank中注冊得到菌株JT-K21的16S rRNA基因序列登錄號為KP216612。

2.2.4 菌株生長曲線 經光譜掃描，菌株JT-K21在660 nm處吸光值最大。由圖4可知，培養12 h后，菌株JT-K12進入對數生長期，24 h后處于穩定期，培養40 h后轉入衰退期，菌株JT-K21整體增長速度相對緩慢。

2.2.5 不同碳氮源對菌株的影響 由圖5可知，解鉀菌對蔗糖的吸收效果最好，此時培養液中菌體濃度及可溶性鉀含量最高，而解鉀菌對淀粉的吸收效果最差。說明同碳源對菌群活性產生不同的影響，結構簡單的單糖更易于菌群吸收營養，從而更好地進行細胞代謝活動。

由圖6可知，以銨鹽（硫酸銨、氯化銨）為氮源時，更有利于菌群的營養吸收；硝酸鹽（硝酸鈉、硝酸鉀）的吸收效果比有機氮源（酵母膏、蛋白胨）好；解鉀菌JT-K21對硫酸銨的吸收效果最好，對蛋白胨的吸收效果最差。

2.2.6 培養基正交試驗 由表3可知，各因素對解鉀菌菌體濃度的影響程度，依次為蔗糖>硫酸銨>氯化鈉>鉀長石；若使解鉀菌菌體濃度最大，則培養基的最優組合為蔗糖（10 g/L）、硫酸銨（0.2 g/L）、氯化鈉（0.1 g/L）、鉀長石（5 g/L）。各因素對解鉀菌發酵液中可溶性鉀含量的影響程度，依次為蔗糖>硫酸銨>鉀長石>氯化鈉；若使解鉀菌發酵液中可溶性鉀含量最大，則培養基的最優組合為蔗糖（10 g/L）、硫酸銨（0.2 g/L）、氯化鈉（0.1 g/L）、 鉀長石（3 g/L）。綜合考慮，在解鉀菌K21的菌體濃度最大化的基礎上，提高其解鉀活性，故最終選擇最優組合（L2）。

3 討論與結論

根際解鉀菌不僅可以改良土壤結構、降解有毒物質，還可以促進植物生長、防治植物病害[16-17]。目前有關與解鉀菌的解鉀機制，大部分研究認為解鉀菌通過分泌酸性代謝物來酸溶及絡合難溶性礦物質，導致晶格結構被破壞，使得鉀、磷等元素游離出來[18-19]，調節土壤理化性質，從而改良土壤結構。而另一部分研究發現解鉀微生物通過分泌酸性物質分解硅酸鹽中的Si-O-Si鍵，破壞晶體結構，使得鉀、鎂等元素游離[20]。

近年來有研究表明，包括根際解鉀菌在內的根際土壤功能菌誘導植物產生生長激素、增強植物對環境的忍耐力及對病原菌的抗性[21-22]，以達到促生防病的作用。雖然解鉀菌有改良土壤環境、促生防病等作用，但由于氣候、土壤類型及理化結構、植物品系的不同，使得從植物根際土壤分離出的解鉀菌的解鉀能力存在較大差別。如盛下放等[23-24]分離篩選的解鉀硅酸鹽細菌NBT 菌株，其釋鉀量較對照增加了226.0%；而李新新等[25]從江西紅壤中篩選到一株類芽孢桿菌屬的解鉀菌株G4，其解鉀效率為27.62%。本研究結果發現，解鉀率在80%以上的菌株有3株（菌株JT-K21、JT-K11、JT-K18），而菌株JT-K21解鉀率達到221.18%。JT-K21的最佳培養基組分為蔗糖10 g/L，CaCO3 5.0 g/L，Na2HPO4 0.2 g/L，（NH4）2SO4 0.2 g/L， MgSO4·7H2O 0.3 g/L， NaCl 0.2 g/L， CaSO4·2H2O 0.2 g/L， 鉀長石粉（150 目）5 g/L，去離子水。下一步將對菌株JT-K21的液體發酵條件進行研究，以便降低大規模發酵生產成本，有利于專用生物復合肥的推廣與應用，從而改善人工種植降香黃檀、檀香的根際微生態環境。

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