龍脷葉總游離氨基酸含量測定

譚建寧 杜成智 梁臣艷 何翠薇

摘要：【目的】建立龍脷葉總游離氨基酸含量的測定方法，為龍脷葉藥材質量控制及其開發利用提供參考依據。【方法】以谷氨酸為對照品，通過正交試驗優化龍脷葉總游離氨基酸的提取條件，并利用紫外—可見分光光度法測定其含量。【結果】龍脷葉總游離氨基酸最佳提取條件為：龍脷葉粉碎過20目篩、液料比25.0∶1、提取時間1.5 h，其中粉碎度和提取時間對龍脷葉總游離氨基酸提取效果的影響顯著（P<0.05）。568 nm是龍脷葉供試品溶液和谷氨酸對照品溶液的檢測波長；谷氨酸在20.0～60.1 μg/mL范圍內與吸光值呈良好的線性關系（R2=0.9991）。在最佳提取條件下，測得6批龍脷葉總游離氨基酸含量（以谷氨酸計）在2.82%～6.77%，平均含量為4.50%。【結論】采用紫外—可見分光光度法測定龍脷葉總游離氨基酸含量，操作簡便、結果準確，可作為龍脷葉總游離氨基酸的質量控制方法。

關鍵詞： 龍脷葉；總游離氨基酸；紫外—可見分光光度法；正交試驗；含量測定

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）04-0645-05

0 引言

【研究意義】龍脷葉為大戟科植物龍脷葉（Sauropus spatulifolius Beille）的干燥葉（國家藥典委員會，2015），主要分布于廣西、廣東、福建等地，作為廣西常用中草藥已被《廣西本草選編》（廣西壯族自治區革命委員會衛生局，1974）和《廣西藥用植物名錄》（廣西壯族自治區中醫藥研究所，1986）收載。龍脷葉為廣西特色中藥，具有通氣道、潤肺止咳、滑腸通便等功效，是臨床上常用壯藥（廣西壯族自治區食品藥品監督管理局，2008）。龍脷葉既可藥用，又可食用，華南地區民間常用其煲涼茶以祛痰化濕，也可與瘦豬肉或豬肺同煮，對肺熱咳嗽、失音、喉痛、急性支氣管炎、上呼吸道炎等癥具有一定的保健作用。廣西龍脷葉資源豐富，深入研究其藥用成分，對龍脷葉的藥用開發與利用具有重要意義，也有利于促進廣西中藥民族醫藥的可持續發展。【前人研究進展】龍脷葉含有皂苷、甾體類和氨基酸等成分（廣東省食品藥品監督管理局，2004），但目前有關龍脷葉化學成分研究的文獻報道較少，且主要集中在龍脷葉水提物的作用研究。汪小根和邱蔚芬（2007）采用氣—質聯用分析法從龍脷葉揮發油中鑒定出16種成分，主成分為棕櫚酸（28.43%）、金合歡基丙酮（8.82%）等。劉蓉（2009）的研究結果表明，龍脷葉的水提物為低毒性，對急、慢性炎癥均有明顯的拮抗作用，并有較強的抑菌作用。黃燕等（2014）采用連續二倍梯度瓊脂稀釋法研究龍脷葉水提液和50%、70%、95%乙醇提取物的抑菌活性，結果顯示，龍脷葉水提液和50%乙醇提取物的正丁醇部位對6種試驗菌株有明顯的抑制作用。陳珍（2014）采用薄層鑒別法考察龍脷葉水提液的正丁醇萃物，并對皂苷和氨基酸部分進行定性鑒別，顯色后，可見明顯的斑點出現。何鵬等（2014）采用高效液相色譜法對15批龍脷葉中具有抗炎、止咳、解痙、抗潰瘍等功效的黃酮苷成分山柰酚-

3-O-龍膽二糖苷的含量進行測定，得知其平均含量為0.0446%。【本研究切入點】游離氨基酸是一種重要生物活性物質，參與植物中氮和蛋白質的代謝（Egydio et al.，2013）。龍脷葉水提液中含有氨基酸，但至今未見有關龍脷葉中總游離氨基酸含量測定的研究報道。【擬解決的關鍵問題】以谷氨酸為對照品，通過正交試驗對龍脷葉總游離氨基酸的提取條件進行優化，并利用紫外—可見分光光度法測定其含量，建立一種快速、準確測定龍脷葉總游離氨基酸含量的方法，為龍脷葉藥材質量控制及其開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

龍脷葉藥材于2014年6～10月分3次購自玉林藥材批發市場，其中批號141001和141002（產地：廣西靖西縣）購于6月，批號141003、141005（產地：廣西梧州市）和批號141004（產地：廣西玉林市）購于8月，批號141006（產地：廣西梧州市）購于10月。

谷氨酸對照品（批號140690-201203）購自中國食品藥品檢定研究院；95%乙醇、冰乙酸、茚三酮、醋酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。試驗用水為去離子水。主要儀器設備：8453型紫外—可見分光光度計（美國安捷倫公司）、BP211D電子天平（德國賽多利斯公司）、CD-UPT超純水機、KQ5200B型超聲提取儀、DK-98-∏A恒溫水浴鍋、FW135型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）、PHS-25 pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）、BT600電子天平（南通市啟東友銘衡器有限公司）。

1. 2 溶液配制

1. 2. 1 谷氨酸對照品溶液制備 精密稱取25.06 mg谷氨酸置于25 mL容量瓶中，以去離子水溶解，定容至刻度，作為儲備液。精密吸取上述儲備液5.0 mL置于50 mL容量瓶中，以去離子水定容至刻度，制得100.2 μg/mL谷氨酸對照品溶液。

1. 2. 2 供試品溶液制備 精密稱量龍脷葉藥材（批號141005）粉末（過20目篩）4.0 g置于250 mL具塞錐形瓶中，加入100.0 mL去離子水，稱定重量，提取1.5 h；補足重量，搖勻，靜置后以0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液作為供試品儲備液。精密吸取上述供試品儲備液0.5 mL置于25 mL容量瓶中，以去離子水稀釋至刻度，作為供試品溶液。

1. 2. 3 pH 6.0緩沖溶液配制 取醋酸鈉54.6 g，加20.0 mL 1 mol/L醋酸溶液溶解后，加水稀釋至500.0 mL，即得pH 6.0緩沖溶液。

1. 3 檢測波長選擇

精密吸取供試品溶液和谷氨酸對照品溶液各1.0 mL，分別置于10 mL試管中，再加入pH 6.0緩沖溶液2.0 mL和2.0%茚三酮溶液1.5 mL，置于沸水中加熱15 min，顯色。采用紫外—可見分光光度法，用1 cm比色皿，以試劑空白作參比，在400～800 nm范圍內掃描吸收曲線，確定檢測波長。

1. 4 標準工作曲線繪制

準確吸取2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL谷氨酸對照品溶液分別置于10 mL容量瓶中，以去離子水定容至刻度，搖勻，作為谷氨酸標準溶液系列液；依次吸取1.0 mL置于10 mL試管中，分別加入pH 6.0緩沖溶液2.0 mL和2.0%茚三酮溶液1.5 mL，沸水中加熱15 min，顯色。以試劑空白作參比，于568 nm處測定吸光值。以谷氨酸質量濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標，繪制標準工作曲線（圖1），其回歸方程為：y=0.0128x+0.0424（R2=0.9991）。谷氨酸在20.0～60.1 μg/mL范圍內與吸光值的線性關系良好。

1. 5 龍脷葉總游離氨基酸提取正交試驗

在預試驗的基礎上，選擇以去離子水超聲波提取龍脷葉總游離氨基酸。選取對龍脷葉總游離氨基酸提取影響較大的藥材粉碎度（A）、提取時間（B）、液料比（C）作為考察因素，進行L9（34）正交試驗。稱取龍脷葉藥材（批號141005）9份，按照1.2.2的方法制備供試品溶液，按照1.4的方法顯色，于568 nm處測定吸光值。正交試驗因素水平設計見表1。

1. 6 驗證試驗

取龍脷葉藥材（批號141005）粉末（過20目篩）5份，在最佳提取工藝下進行總游離氨基酸提取，按照1.2.2的方法制備供試品溶液，按照1.4的方法顯色后，于568 nm處測定吸光值，驗證最佳提取工藝的可靠性。

1. 7 龍脷葉總游離氨基酸含量測定

精密稱量6批龍脷葉藥材，按照1.2.2的方法制備供試品溶液，分別精密吸取1.0 mL置于10 mL試管中，搖勻；按照1.4的方法顯色后，以試劑空白作參比，于568 nm波長處測定吸光值，每個樣品平行測定3次，計算龍脷葉總游離氨基酸含量（以谷氨酸計）。計算公式如下：

總游離氨基酸含量（%）=C×5000×V×100/（M×106）

式中，C為供試品溶液測得的吸光值代入標準工作曲線后計算的谷氨酸質量濃度（μg/mL），V為供試品溶液體積（mL），M為龍脷葉藥材質量（g）。

2 結果與分析

2. 1 檢測波長的確定

在400～800 nm范圍內掃描龍脷葉供試品溶液與谷氨酸對照品溶液的吸收曲線，結果（圖2）顯示，供試品溶液與谷氨酸對照品溶液的最大吸收波長均為 568 nm，因此，確定568 nm作為檢測波長。

2. 2 龍脷葉總游離氨基酸提取條件的確定

由表2可知，影響龍脷葉總游離氨基酸提取效果的因素主次排序為：A>B>C，即粉碎度是主要影響因素，其次為提取時間，而液料比的影響相對較小；其中，粉碎度和提取時間對龍脷葉總游離氨基酸提取效果有顯著影響（P<0.05）（表3）。最佳提取工藝組合為A3B3C2，即龍脷葉總游離氨基酸最佳提取工藝條件為：粉碎過20目篩、提取時間1.5 h、液料比25.0∶1。

2. 3 驗證試驗結果

驗證試驗結果表明，在工藝組合A3B3C2的提取條件下，龍脷葉總游離氨基酸平均含量為6.77%，高于正交試驗各組合的含量，說明正交試驗結果可靠。龍脷葉總游離氨基酸最佳提取條件確定為：過20目篩粉碎、提取時間1.5 h、液料比25.0∶1。

2. 4 龍脷葉總游離氨基酸含量的測定結果

從表4可以看出，6批龍脷葉總游離氨基酸含量存在較大差異，以購于8月批號141005（產地：廣西梧州市）的含量最高，為6.77%；其次是同樣購于8月的批號141003（產地：廣西梧州市），其總游離氨基酸含量為6.50%；總游離氨基酸含量最低的是批號141001（產地：廣西靖西縣），為2.82%；6批龍脷葉總游離氨基酸的平均含量為4.50%。

3 討論

氨基酸成分的測定常采用紫外—可見分光光度法、氨基酸自動分析儀法、高效液相色譜法、氣相色譜法等。其中，氨基酸自動分析儀法測定的氨基酸為鹽酸水解蛋白質和植物本身含有的游離氨基酸，但過層析柱后需與水合茚三酮衍生劑衍生，造成峰形變寬，分辨率降低；高效液相色譜分析法測定的是在分離蛋白或限制蛋白水解條件下各游離氨基酸含量，分析時需在過層析柱前衍生，易污染色譜柱，造成柱效降低；氣相色譜法需把氨基酸衍生為易氣化的物質，且適用于氨基酸衍生的衍生試劑不多，衍生操作復雜（劉榮森等，2007；吳琴燕等，2014）。紫外—可見分光光度法常用于測定總游離氨基酸，顯色劑主要有茚三酮、吲哚醌等（曾俊和蘇俊黎，2003；黃松等，2010），可直觀反映植物中本身含有的游離氨基酸含量，操作簡便，準確可靠，且儀器價格低廉。

本研究采用紫外—可見分光光度法測定龍脷葉總游離氨基酸含量，結果顯示，不同批次間的龍脷葉總游離氨基酸含量差異較明顯，含量最高和最低相差近2.5倍。廣西靖西縣的兩批龍脷葉總游離氨基酸含量在6批藥材中最低，僅為2.82%和2.74%；購于8月的3批龍脷葉藥材中有廣西梧州和玉林市兩個產地，其中廣西梧州市的兩批藥材含量高，分別達6.50%和6.77%，廣西玉林市的龍脷葉總游離氨基酸含量僅3.66%，相差近1.8倍；分別購于8月和10月的龍脷葉，產地同為廣西梧州市，購于10月的龍脷葉總游離氨基酸含量相較于8月的含量有所下降，為4.51%。因此推測龍脷葉總游離氨基酸含量受產地、采收時間等因素影響較大，但具體原因有待進一步探究。氨基酸含量高低決定植物的品質，6批龍脷葉總游離氨基酸的平均含量為4.50%（以谷氨酸計），高于鐵皮石斛總氨基酸含量0.327%（以天冬氨酸計）（王培培等，2013），提示龍脷葉品質高，可作為保健食品進一步開發和利用。

氨基酸的存在形式一般有兩種，一種是游離態，一種是結合到蛋白質中。游離氨基酸的抗感染能力顯著，有研究表明，游離氨基酸中的組氨酸、蘇氨酸缺乏可促使小鼠對傷寒沙門氏菌的易感性增高，賴氨酸缺乏導致小鼠對炭疽芽孢桿菌的抵抗力下降，而皮下注射半胱氨酸可增強動物一些非特異性免疫功能及對葡萄糖球菌毒素的抵抗力（徐琪壽，1996）。本課題組前期研究發現，龍脷葉中含有谷氨酸、組氨酸、蘇氨酸、賴氨酸等多種游離氨基酸；本研究測定龍脷葉總游離氨基酸含量，可為深入研究龍脷葉抑菌、抗炎、鎮痛等活性成分提供實驗基礎。下一步將對多種游離氨基酸的含量進行測定，為龍脷葉藥材資源的綜合利用提供更多理論依據。

4 結論

采用紫外—可見分光光度法測定龍脷葉總游離氨基酸含量，操作簡便、結果準確，可作為龍脷葉總游離氨基酸的質量控制方法。

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（責任編輯 羅 麗）