人結直腸癌BRAF基因V600E突變的檢測方法

摘要：為了探討人結直腸癌BRAF基因V600E突變的檢測方法，文章通過等位基因特異性擴增技術檢測80例結直腸癌石蠟標本的BRAFV600E突變性，且與Sanger測序法進行對比，得出結論：通過等位基因PCR技術檢測人結直腸癌BRAF基因V600E突變，與測序法對比靈敏度、簡便性、快速性更高，對人腫瘤BRAFV600E突變具有較高的篩查價值。

關鍵詞：人結直腸癌；等位基因；特異性擴增；BRAF基因；V600E突變 文獻標識碼：A

中圖分類號：R735 文章編號：1009-2374（2016）24-0072-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2016.24.036

目前，臨床中有超過30種BRAF突變類型，大約90%突變處在第15外顯子，而V600E突變則是最為常見的一種突變。本文將人BRAF基因V600E突變位點作為等位基因特異性擴增引物，經等位基因特異性擴增技術檢測且與金標準Sanger測序法，分析其可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選用的人大腸癌SW480、HT29細胞均通過測序顯示為BRAF野生型、攜帶BRAFV600E雜合突變。80例結直腸癌標本均由醫院病理科提供。其DNA腫瘤組織切片通過鏡檢顯示腫瘤細胞水平超過90%。

1.2 方法

提取DNA，并將模板DNA放置到-20℃環境內保存。等位基因特異性擴增法：將人大腸癌細胞株SW480、HT29與80例腫瘤標本予以等位基因特異性擴增，PCR體系總體積是20μL ，含有Mg2+buffer2μL，dNTPmixture1.5μL，上、下游引物各有0.5μL（10μmol），模板DNA30ng，置入滅菌去離子水達到20μL。通過95℃預變性30s；95℃變性10s；67℃退火20s；72℃延伸30s，總45個循環進行反應。將腫瘤標本取出1μL進行第一次擴增，并將其產物用作二次擴增物，采用同樣擴增方法。將PCR產物采集5μL實施瓊脂糖（2%）凝膠電泳，持續30min，然后予以顯像。

標本與細胞株均通過PCR測序且對比等位基因特異性擴增的結果。PCR反應條件為：含有Mg2+buffer2μL，dNTPmixture1.5μL，上、下游引物各有1μL（（10μmol），模板DNA30ng，置入滅菌去離子水達到20μL。……