吉林市左家地區珊瑚菌遺傳多樣性的AFLP分析

王鳳蘭 王霞 于曉明

摘要：以吉林市左家鎮3個地區的18株野生珊瑚菌樣品為研究材料，應用AFLP分子標記方法，分析其遺傳多樣性水平。結果發現，左家地區珊瑚菌具有較高的遺傳多樣性，AFLP多態位點百分率為85.4%，遺傳距離在0.223～0.712之間，相似系數的變化范圍在0.442～0.824之間。應用UPGMA聚類分析表明，所檢測的18株野生珊瑚菌樣品的遺傳距離與采樣地點有明顯關聯，并且ZJ居群野生珊瑚菌的遺傳多樣性遠高于LT居群和FM居群。

關鍵詞：珊瑚菌；AFLP；遺傳多樣性；遺傳分化

基金項目：吉林農業科技學院微生物學重點學科培育項目（吉農院合字〔2013〕第X009號）；吉林農業科技學院大學生科技創新項目（吉農院合字〔2015〕第 041號）

中圖分類號： Q75 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.03.022

珊瑚菌（Clavicorona pyxydata），也稱“掃帚菌”，屬珊瑚菌科（Clavariaceae），其形狀多樣，顏色鮮艷，是我國野生食用菌中的一種重要資源。而傳統醫學認為，珊瑚菌具有補鈣、鎮靜的食補功效。有研究表明，珊瑚菌具有抗癌作用，珊瑚菌的水煎劑對體外培養的乳腺癌細胞株有明顯的抑制作用，可以作為抗乳腺癌的良好備選藥物。珊瑚菌在我國分布廣泛，其中常見種有葡萄枝瑚菌、密枝瑚菌、杯珊瑚菌、冠鎖瑚菌、須瑚菌、棒瑚菌、平截棒瑚菌等。由于珊瑚菌的高經濟價值而且目前尚不能進行商業化栽培，因此目前市場上消費的產品幾乎全部來自野生。目前，國內僅對山東省、河南省、秦巴山區和雞足山地區的野生珊瑚菌進行了資源調查，而有關珊瑚菌遺傳多樣性結構狀況研究尚未開展。在眾多分子生物學遺傳多樣性研究方法中，AFLP分子標記技術具有實驗操作簡單、快速、高效、遺傳多態性高、重復性好等特點，其檢測遺傳位點效率高于ISSR和SSR等技術。通過AFLP位點遺傳多樣性分析，可以檢測居群的遺傳多樣性水平；通過遺傳多樣度、基因多樣度各指數的分析可以了解居群的遺傳結構和遺傳分化；分析群體間的遺傳相似性和遺傳距離；通過聚類分析獲得顯示各居群間親緣關系的進化系統。本研究運用AFLP分子標記技術在分子水平上探討吉林市左家地區18株的珊瑚菌親緣關系和遺傳多樣性，旨在揭示珊瑚菌遺傳多樣性水平，遺傳結構及其遺傳分化，為珊瑚菌這一重要食（藥）用資源保護與利用奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

從吉林市左家鎮三個地區采集18株野生珊瑚菌子實體（三個居群，分別編號為LT1-6，FM1-6和ZJ1-6），樣品采集后用硅膠干燥并置于密封袋中。

1.2主要試劑

AFLP接頭、預擴增引物和選擇性擴增引物由上海生工公司合成；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP和DNA ladder Mix購自Takara公司。

1.3珊瑚菌總DNA 的提取

稱量珊瑚菌子實體干燥樣品0.2克，采用改良的CTAB法[7]提取珊瑚菌基因組DNA，加100μL的TE緩沖液溶解總DNA，-20℃凍存備用。

1.4 AFLP擴增

1.4.1 酶切與接頭連接 酶切反應體系為1×T4 ligation buffer，1U EcoRI，1U MseI，100μmol/L EcoRI接頭，100μmol/L MseI 接頭，1U T4 ligase，200ng基因組DNA，加水補足到總反應體積為30μL。混勻反應體系，在37℃條件下酶切4 小時，繼續在16℃條件下連接8 小時后4℃保存。

1.4.2預擴增和選擇性擴增 本文所用的預擴增引物和熒光標記的選擇性擴增引物由Invitrogen公司合成。預擴增反應體系為25μL，包括1×反應緩沖液，300μmol/L dNTPs，350μmol/L引物，0.5U ExTaq DNA聚合酶，1μL基因組DNA酶切產物作為模板。PCR反應條件為95 ℃預變性5分鐘，94℃變性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒，35次循環，72℃延伸10min，4℃保存。預擴增PCR反應產物稀釋20倍作為選擇性擴增PCR的模板。選擇性擴增反應體系為25μL，包括1×反應緩沖液，300μmol/L dNTPs，350μmol/L引物，0.5U ExTaq DNA聚合酶，1μL稀釋好的預擴增產物作為模板。PCR反應條件為95 ℃預變性5分鐘，94℃變性45秒，65℃退火45秒，72℃延伸90秒，10次循環，每輪循環溫度遞減1℃，94℃變性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒，35次循環，72℃延伸10分鐘，4℃保存。反應產物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳 80 V電壓下電泳60 分鐘，用凝膠成像系統觀察照相。

1.4.3AFLP選擇性擴增結果的檢測與分析 AFLP選擇性擴增產物送交長春華大中天生物技術有限公司進行毛細管電泳和熒光信號讀取。進行統計AFLP擴增條帶時，熒光信號值大于80時認為有條帶記錄為1，小于80時認為沒有條帶記錄為0。應用NTSYS-pc2.1軟件計算樣品之間的相似系數，并進行UPGMA聚類分析。根據遺傳距離用Mega3.0軟件UPGMA法聚類分析構建系統樹。

2結果與分析

2.1珊瑚菌的遺傳距離和相似系數分析

通過一共從36對選擇性擴增的引物組合中讀取3227條帶，其中多態性條帶有2758條（占85.4%）。遺傳距離（Genetic Distance）和相似系數（Genetic Identity）是用來衡量種群之間遺傳分化程度的重要指標用POPGENE 32軟件對吉林市左家鎮18株珊瑚菌（3個取樣地點）進行遺傳距離和相似系數分析，結果見表1。

3個珊瑚菌群間的遺傳距離的變化范圍在0.223～0.712之間，相似系數的變化范圍在0.442～0.824之間。珊瑚菌居群 ZJ與居群FM之間的遺傳距離最小，為0.223 相似系數也是最高的為0.824。左家地區珊瑚菌居群 ZJ與居群LT之間的遺傳距離最大，為0.712，同樣相似系數是最低的，為0.442。

2.2珊瑚菌樣品間和居群間的親緣關系聚類分析

用軟件NTSYS-pc 2.1對18個試驗樣品相似系數進行分析，使用UPGMA法進行聚類分析，結果見圖1。

圖1表明ZJ-3號和ZJ-5號樣品的相似性最大，相似系數為0.79，說明這2個樣品的親緣關系最為接近。聚類圖在相似系數約為0.50處可劃分為三大組，第1組包括9份資源，組內又可劃分2個亞組。第2組包括4份資源。其他分散的樣品為LT居群的5份資源，相互之間遺傳差異較大。上述結果表明左家地區居群（ZJ）和居群（FM）的親緣關系近，而居群（LT）與前兩者親緣關系較遠。

3結語

隨著人們對食用珊瑚菌興趣的增加，野生珊瑚菌資源受到了巨大的威脅。吉林市左家地區具有豐富的野生珊瑚菌資源，為了了解野生珊瑚菌遺傳多樣性，避免野生珊瑚菌遺傳多樣性的散失，本文通過分析左家鎮3個地點的18株野生珊瑚菌樣品的遺傳多樣性水平，發現左家珊瑚菌具有較高的遺傳多樣性，AFLP多態位點百分率為85.4%，高于羊肚菌（79.55%）、松茸（76.92%）和冬蟲夏草（69.60%），而低于美味牛肝菌（93.34%）[10]。而野生珊瑚菌遺傳相似性的UPGMA聚類圖（圖1）以及遺傳距離和遺傳相似性分析（表1）表明左家鎮ZJ居群野生珊瑚菌的遺傳多樣性遠高于LT居群和FM居群。這一現象可能表明左家鎮的ZJ居群的野生珊瑚菌資源保護較好，而LT居群和FM居群的野生珊瑚菌資源可能因為人類活動已經遭到了一定程度的破壞。

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作者簡介：王鳳蘭，吉林農業科技學院，本科在讀，研究方向：生物工程。

通訊作者：于曉明，碩士，吉林農業科技學院，講師，研究方向：分子生物學與基因工程。