嗜熱菌β—葡萄糖苷酶A水解大豆異黃酮的研究

王銳麗

摘 要：該研究將含嗜熱乙醇菌β-葡萄糖苷酶A（Te-BglA）基因的重組質粒pET-20b-Te-BglA導入大腸桿菌JM109（DE3）中，經誘導表達和Ni2+親和層析純化，將其用于酶解大豆異黃酮，以染料木素的產量為檢測指標，通過正交試驗優化Te-BglA水解大豆異黃酮的條件。優化結果顯示：最佳的水解條件為加酶量70U，溫度80℃，水解時間60min，pH值7.4，在此條件下水解100g大豆粉可得到染料木素58.1mg。

關鍵詞：β-葡萄糖苷酶；染料木素；大豆異黃酮糖苷；正交試驗

中圖分類號 TS201 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）18-0026-03

Hydrolysis of Soybean Isoflavone by β- Glucosidases A from Thermoanaerobacter etholicus

Wang Ruili

（Department of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Xinyang Agriculture and Forestry University，Xinyang 464000，China）

Abstract：To obtain a high stability and efficiency enzyme in the biotransformation of isoflavone glycosides，β-glucosidase A from Thermoanaerobacter ethanolicus（Te-BglA）was over-expressed in Escherichia coli JM109（DE3），and purified by immobilized metal affinity chromatography. The hydrolysis conditions of soybean isoflavone by Te-BglA were by orthogonal test，Results were as follows：enzyme dose 70U，temperature 80℃，time 60min and pH 7.4. Under the optimal condition，the yield of genistein in the hydrolysis of 100g soybean powder was 58.1mg.

Key words：β-glucosidase；Genistein；Soybean isoflavone glucosides；Orthogonal test

大豆異黃酮因具有緩解更年期綜合征、抗腫瘤、延緩衰老、抗輻射等功效而成為了國內外的研究熱點[1-3]，目前研究發現的12種大豆異黃酮主要有游離型苷元和結合型糖苷兩種類型，而被人體腸道吸收的是它的苷元形式，糖苷形式必須轉化為相應的苷元才能真正發揮藥效。大豆異黃酮糖苷水解酶（β-葡萄糖苷酶）水解或相關微生物發酵因條件溫和而成為一種理想的轉化途徑[4-6]，目前雖有很多來源細菌或真菌轉化大豆異黃酮糖苷β-葡萄糖苷酶的報道，但有關耐熱性高效水解糖苷的β-葡萄糖苷酶的報道卻很少。耐熱性酶在生物轉化過程中具有減少污染、加快反應速度、提高底物溶解度及易于大規模生產等優勢[7]。本研究利用基因工程方法實現嗜熱性β-葡萄糖苷酶A（Te-BglA）在大腸桿菌中的重組表達和純化，通過正交試驗對其酶解大豆粉中大豆異黃酮糖苷作用進行研究，以確定最佳酶解條件，以期為實際生產中提高苷元的產量提供一定的工藝參數。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株和質粒：嗜熱厭氧乙醇菌JW200（Thermoanaerobacter ethanolicus JW200），由美國佐治亞大學微生物系Wiegel博士分離并贈送。重組質粒pET-20b-Te-BglA由前期研究構建保存。主要試劑：對硝基苯酚-β-葡萄糖苷（pNPG）、染料木素（Genistein，縮寫G）、染料木苷（Gensitin，Gin）和大豆黃苷（Daidzin，Din）購自Sigma公司；丙二酰基染料木苷（6-malonyl-gensitin，M-Gin）、大豆黃素（Daidzein，D）、丙二酰基大豆黃苷（6-malonyl-daidzin，M-Din）購自WAKO公司。

1.2 方法

1.2.1 重組酶的表達和純化 將重組質粒pET-20b-Te-BglA電轉化于E.coli JM109（DE3），挑取單菌落接入含Amp抗性的LB培養液中，37℃培養過夜。然后以1.5%接種量接入到含Amp抗性750mL LB培養液中，振蕩培養至OD600達0.8左右加入IPTG至濃度0.05mM，繼續誘導培養5h后，離心，收集細胞。用Rapid Affinity Purification Kit中的結合緩沖液（Binding Buffer）懸浮細胞，經高壓破碎，離心20min，取上清液于70℃下熱處理20min，離心得粗酶液。粗酶液再經Ni2+親和層析純化，快速提取法按Novagen的產品說明進行，以每1mL收集酶活的峰值部分，以SDS-PAGE凝膠電泳檢測純度。

1.2.2 酶的活性測定 β-葡萄糖苷酶活性由從底物pNPG釋放對硝基苯酚（pNP）的量確定，采用分光光度法[7]。一個酶活力單位（U）定義：在一定反應條件下，1min內催化產生1μmol pNP的酶量。大豆異黃酮水解酶活性是從底物Genistin、M-Gin釋放出Genstein的量，從底物Daidzin、M-Din釋放出Daidzein的量來確定，采用HPLC法[8]分析。條件：Agilent HC-C18，UV detector 260nm；30℃；流動相：A，0.1%的磷酸水溶液，B，乙腈，45min內，A由85%降至65%；流速：0.8mL/min[9]。一個酶活單位（U）定義為在該條件下，1min內催化產生1μmol的苷元類物質（Genstein、Daidzein）所需要的酶量，以峰面積對標準品質量作標準曲線。

1.2.3 大豆粉的酶解實驗 稱取0.1g脫脂大豆粉，以料液比1∶10溶于pH7.0，250mM的磷酸緩沖液中，加酶量為50U/g（對照為不加酶），然后于80℃分別酶解90min，在冰浴條件下終止反應，離心，收集上清，冷凍干燥。經干燥后的上清干粉與沉淀分別用1mL 80%甲醇重懸，30℃提取2h，離心20min，取上清，經過濾后取20μL進行HPLC分析。異黃酮苷元產量用100g脫脂大豆粉產生的多少毫克（mg）數表示。

1.2.4 正交試驗設計 根據對重組酶Te-BglA酶學性質研究的結果，設計了四因素四水平的正交試驗，考察各因素對酶水解的影響。其因素和水平的設計見表1，每組重復3次，以水解后染料木素的產量為檢測標準，確定其最佳水解條件。

2 結果與分析

2.1 重組酶的表達和純化 將重組質粒pET-20b-Te-BglA轉化E.coli JM109（DE3），挑取單菌落于液體LB培養基中經IPTG誘導后，收集細菌經高壓破碎，上清液經熱處理和Ni2+親和層析兩步純化操作，所得重組酶經SDS-PAGE檢測達到電泳均一（圖1）。

圖1 SDS-PAGE電泳檢測重組酶Te-BglA的純化

2.2 正交設計結果及分析 根據對加酶量、水解溫度、水解時間及pH值進行四因素四水平正交設計，選用L16（45）正交表，并加一空列，作為試驗誤差以衡量試驗的可靠性。其試驗方案及結果如表2，結果極差分析如表3，方差分析如表4。由表3和表4可知，影響重組酶Te-BglA水解大豆異黃酮效率的主次因素依次為A（加酶量）>C（時間）>B（溫度）>D（pH值）。其中A加酶量對染料木素產量的影響最顯著，其次是水解時間。由極差分析表3可知，最佳水解條件的組合為A4B3C2D4，即加酶量70U，溫度80℃，水解時間60min，pH值7.4。

2.3 驗證試驗 以組合A4B3C2D4為水解條件時，3次重復驗證試驗所得100g大豆粉中染料木素的產量為58.1mg，大于正交試驗方案的最大值55.3mg，因此可以證明，A4B3C2D4即加酶量70U，溫度80℃，水解時間60min，pH值7.4是嗜熱性β-葡萄糖苷酶A水解大豆異黃酮的最佳條件。

3 結論

本研究將含嗜熱乙醇菌β-葡萄糖苷酶A（Te-BglA）基因的重組質粒pET-20b-Te-BglA導入大腸桿菌JM109（DE3）中，經誘導表達和Ni2+親和層析純化，將其用于酶解大豆異黃酮糖苷。糖苷形式的大豆異黃酮不具有最佳的生理活性狀態，須在大豆異黃酮糖苷酶的作用下轉化成苷元形式才能被吸收而發揮藥效[10，11]。為獲得更多的苷元產物，以染料木素為檢測目標，本研究通過優化酶解的條件，以提高β-葡萄糖苷酶A水解效率，通過正交試驗最終確定最佳的水解條件為加酶量70U，溫度80℃，水解時間60min，pH值7.4，在此條件下染料木素的產量達到58.1mg。

參考文獻

[1]Wada K，Nakamura K，Tamai Y，et al.Soy isoflavone intake and breast cancer risk in Japan：From the Takayama study[J].Int J Cancer，2013，133（4）：952-960.

[2]Lima F S，Idae I.Optimisation of soybean hydrothermal treatment for the conversion of β-glucoside isoflavones to aglycones[J].Food Science and Technology，2014，56（2）：232-239.

[3]翟清燕.高產游離型大豆異黃酮乳酸菌的篩選鑒定及其在發酵豆乳中的應用[D].泰安：山東農業大學，2014.

[4]Yeom S J，Kim B N，Kim Y S，et al.Hydrolysis of isoflavone glycosides by a thermostable β-glucosidase from Pyrococcus furiosus[J].J Agric Food Chem，2012，60（6）：1535-1541.

[5]孫正博，吳周和，董青，等.大豆異黃酮β-葡萄糖苷酶產生菌的選育及產酶條件研究[J].中國釀造，2006，5：7-11.

[6]Kim B N，Yeom S J，Kim Y S.Characterization of a β-glucosidase from Sulfolobus solfataricus for isoflavone glycosides[J].Biotechnology Letters，2011，34（1）：125-129.

[7]Xue Y M，Yu J J，Song X F.Hydrolysis of soy isoflavone glycosides by recombinant β-glucosidase from hyperthermophile Thermotoga maritima[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2009，36（11）：1401-1408.

[8]Xue Y M，Song X F，Yu J J.Overexpression of β-glucosidase from Thermotoga maritima for the production of highly purified aglycone isoflavones from soy flour[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2009，25（12）：2165-2172.

[9]Chuankhayan P，Rimlumduan T，Svasti J，et al.Hydrolysis of soybean isoflavonoid glycosides by Dalbergia β-glucosidase[J].J Agric Food Chem，2007，55（6）：2407-2412.

[10]Ismail B，Hayes K. β-Glycosidase activity toward different glycosidic forms of isoflavones[J].J Agric Food Chem，2005，53（12）：4918-4924.

[11]Maitan-alfenas G P，Alage L G，Almerida M，et al.Hydrolysis of soybean isoflavones by Debaryomyces hansenii UFV-1 immobilised cells and free β-glucosidase[J].Food Chemistry，2014，146：429-436.