微小RNA—22在食管癌中的表達及臨床意義

胡立華　陳鵬　常英娟

[摘要] 目的 探討微小RNA-22（miRNA-22）在食管癌組織中的表達及與食管癌臨床病理特征間的關系。 方法 采用實時定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）法檢測48例食管癌及癌旁組織中miRNA-22的表達水平，分析miRNA-22表達水平與食管癌患者臨床病理特征之間的關系。 結果 食管癌組織中miRNA-22相對表達量明顯低于相應正常癌旁組織（3.51±1.05 vs 11.23±2.95），差異有統計學意義（P<0.05）。miRNA-22低表達與腫瘤TNM分期及有無淋巴結轉移密切相關，差異有統計學意義（P<0.05）；而與性別、年齡、分化程度無明顯相關性（P>0.05）。 結論 miRNA-22在食管癌組織中的表達下調與食管癌的臨床病理特征密切相關。

[關鍵詞] 微小核糖核酸；食管癌；微小核糖核酸-22；實時定量PCR

[中圖分類號] R735.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）16-0021-03

[Abstract] Objective To investigate the expression of miRNA-22 in esophageal cancer tissues and the relationship with the clinical pathologic features. Methods Real-time PCR was used to detect the miRNA-22 expressions among 48 cases of esophageal cancer tissues and matched adjacent tissues.The expression of miRNA-22 and clinic pathological features were analyzed. Results The esophageal cancer tissues showed aberrant down regulation of miRNA-22 compared with the adjacent non-tumor tissues（3.51±1.05 vs 11.23±2.95， P<0.05）.Lower miRNA-22 level was strongly associated with TNM stage and lymph node metastasis（P<0.05）. The correlation statistical analysis result indicated that there was no significant difference in sex， age and differentiation grade（P>0.05）. Conclusion The lower expression of miRNA-22 in esophageal cancer tissues is associated with clinic pathological features.

[Key words] MicroRNA； Esophageal cancer； MicroRNA-22； Real-time PCR

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1]。由于早期缺乏特異性癥狀，臨床確診的食管癌病例多為中、晚期患者，其5年生存率僅為10%左右。因而探索敏感、特異的腫瘤標記物，早期診斷，對降低食管癌的死亡率尤為重要。研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）表達失調與腫瘤發生、發展密切相關，可作為腫瘤標記物用以腫瘤的診斷及治療。本研究通過檢測miRNA-22在食管癌及癌旁組織中的表達，旨在探討其與食管癌臨床病理特征之間的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2014年1～12月黑龍江省醫院及黑龍江省腫瘤醫院外科手術切除的食管癌及癌旁正常組織標本48例，液氮凍存30 min，-80℃保存，所有樣品均經病理診斷證實，術前均未接受放、化療。其中男34例，女14例，年齡41～88歲。癌癥分期按國家癌癥聯盟（UICC）第7版指南標準劃分，其中Ⅱ期15例，Ⅲ期22例，Ⅳ期11例，分化程度：中分化33例，低分化15例，有淋巴結轉移36例，無淋巴結轉移12例。

1.2 總RNA提取

將食管癌及癌旁正常組織研碎，利用Trizol法提取組織總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，紫外分光光度儀檢測RNA溶液的D260/D280比值，取比值在1.8～2.1者行下一步實驗。

1.3 反轉錄及實時定量PCR（qPCR）檢測miRNA-22

采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉錄，反應條件為：16℃ 30 min，42℃ 45 min，85℃ 5 min。miRNA-22 PCR擴增的上游引物序列為5-AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGTA-3，下游引物序列為5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3。反應條件為：95℃ 10 min，95℃ 15 sec，60℃ 1 min，共40個循環。同時選取U6 snRNA 為內參照，實驗反復3次。U6內參的上游引物5GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3，下游引物R：5CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3。RT-PCR結果以Ct值表示，采用2-ΔΔCt比較各樣品間miRNA-22的表達差異[2]，ΔCt=待檢樣品的miRNA-22 Ct值-該樣品的U6 Ct值，ΔΔCt值=食管癌組織的 ΔCt 值-癌旁組織的ΔCt值。

1.4 觀察指標

以食管癌組織中miRNA-22表達量的中位數為分界點將其分為低表達組和高表達組[3]，分析兩組與食管癌患者性別、年齡、腫瘤分化程度、TNM分期及有無淋巴結轉移的關系。

1.5 統計學方法

采用SPSS13.0統計學軟件對實驗結果進行統計學分析，計量資料組間比較采用t檢驗，計數資料應用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-22在食管癌及癌旁正常組織中的表達

經qPCR技術檢測，食管癌組織中miRNA-22相對表達量為（3.51±1.05），明顯低于相應正常癌旁組織的（11.23±2.95），差異有統計學意義（t=3.831，P<0.05）。

2.2 miRNA-22的表達與食管癌臨床病理特征之間的關系

食管癌組織中miRNA-22表達水平與腫瘤淋巴結轉移和TNM分期（Ⅲ+Ⅳ）密切相關，有淋巴結轉移患者miRNA-22的低表達率為94.4%（34/36），顯著高于無淋巴結轉移患者的41.7%（5/12），Ⅳ期患者miRNA-22的低表達率為90.9%（10/11），明顯高于Ⅲ期患者的81.8%（18/22）和Ⅱ期患者的73.3%（11/15），差異有統計學意義（P<0.05），而與患者性別、年齡及腫瘤分化程度無顯著相關性（P>0.05）。見表1。

3 討論

MicroRNA是一類長約20～22個核苷酸的小分子RNA，由具有發夾結構約70 nt的miRNA前體經過Dicer酶加工后生成[4]，其通過與靶mRNA分子的3端非編碼區（3UTR）互補結合使目標mRNA分子受到翻譯水平調控或導致其降解，參與調控細胞生長分化、能量代謝、凋亡等生理過程[5]。研究發現腫瘤細胞和正常細胞中的miRNA表達譜有明顯差異，約50%已知miRNA基因組定位于與腫瘤相關的脆性位點，通?？梢种颇[瘤細胞的表達[6]。

分子靶向治療是目前腫瘤治療的熱點，大多數靶向治療藥物主要針對與腫瘤相關的信號傳導通路中的某個重要分子，但由于細胞中存在著多種信號傳導通路，阻斷其中一個分子并不能完全起到抑制腫瘤細胞的作用。一個miRNA可以同時作用于多個靶基因，通過調控miRNAs的表達水平或可更廣泛地調控細胞中相關的信號傳導通路，取得更好的抗腫瘤效果。有些miRNA在腫瘤中低表達或不表達，可采用外源miRNA基因導入療法。有些miRNA在腫瘤中高表達，可采用相應的方法下調miRNA的表達。由此可見，尋找與腫瘤相關的miRNAs并明確其在腫瘤發生、發展中的作用對腫瘤的治療具有重大意義。

2002年首次在慢性粒細胞白血病人群中發現，超過50%患者miRNA-15a和miRNA-16-l低表達或缺失[7]，此后陸續發現多種腫瘤中miRNA表達失調[8-14]。Feber等[15]比較了食管癌組織與正常上皮組織中miRNA表達情況，結果發現miRNA-203和miRNA-205在食管癌組織中的表達下調，而miRNA-21的表達上調。Tian等[16]研究指出miRNA-10b在食管癌細胞中表達失調，并通過調控KLF4 基因，參與食管癌的發生。Hiyoshi等[17]檢測20例食管癌及癌旁正常組織和7種食管癌細胞系中miRNA-21的表達，結果顯示：90%的癌組織miRNA-21表達上調，且與程序性細胞死亡基因4表達呈負相關。Zhou等[18]研究發現miRNA-214在食管鱗癌中表達下調并與食管鱗癌的病理分級、TNM分期及淋巴結轉移相關。

本實驗利用實時定量PCR技術，選擇miRNA-22作為研究對象，分析48例食管癌手術患者標本中癌組織與癌旁正常組織中miRNA-22的表達情況，并對臨床病理參數進行縱向比較，結果表明：食管癌組織中miRNA-22的相對表達量顯著低于癌旁正常組織（P<0.05）；食管癌組織中miRNA-22低表達與腫瘤淋巴結轉移和TNM 分期（Ⅲ+Ⅳ）間具有顯著相關性（P<0.05），提示miRNA-22在食管癌發生、發展中很可能具有抑癌基因的作用。因此，采用外源miRNA-22 基因導入或重新激活可能成為抗癌治療新的研究方向。

綜上所述，miRNA-22在食管癌組織中的表達下調與食管癌的發生、發展密切相關，miRNA-22可能成為食管癌診斷及治療的新的分子標志。

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（收稿日期：2016-03-28）