抗感黃曲霉花生種質遺傳多樣性評價與指紋圖譜構建

閆彩霞 張浩 張廷婷 趙小波 李春娟 單世華 孔令讓

摘要：為明確抗感黃曲霉花生種質的遺傳多樣性和親緣關系，發掘優良抗性種質，本研究利用46對多態性SSR引物分析48份抗感黃曲霉或相關花生種質的遺傳多樣性，平均每對引物可擴增出5.15個等位變異，平均PIC值為0.604；聚類分析將48份種質分為8組，其中抗性種質被分成5組；低產毒種質91048、抗侵染種質AR-3、PI337409F和GFA-2以及抗圓柱狀黑腐病種質PERRY與其它種質存在較大的遺傳差異，可作為理想的育種材料；抽取5個標記共35個多態位點建立了48份抗感黃曲霉或相關花生種質的“引物+0，l字符串”計算機化的DNA指紋圖譜。篩選出的優異種質可在抗黃曲霉品種培育中作親本利用，以拓寬其遺傳基礎。

關鍵詞：抗黃曲霉；遺傳多樣性；聚類分析；指紋圖譜

中圖分類號：S565.202.4

文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）01-0001-06

花生（Arachis hOpogaea L.）是重要的油料和經濟作物，是眾多發展中國家主要的油脂和蛋白質來源，但同時花生也是易受黃曲霉毒素污染的農作物之一。黃曲霉毒素（Aflatoxin）是一種強致癌生物毒素，它對花生及其加工產品的污染已成為影響農產品質量和食品安全的主要問題之一，嚴重威脅人類健康，制約全球花生產業的持續發展。

花生對黃曲霉毒素污染的抗性主要有兩種類型，即抗侵染和抗產毒。抗侵染的種質較多，從1973年開始，先后篩選出J11、P1337394F、P1337409、GFA-l、GFA-2、AR-1、AR-2、AR-3、AR-4、ACC63、CES48-30等近40份高抗、中抗種質，黃曲霉菌在這類花生種質上很難侵染和定殖，這是一種基于種皮結構及生化成分的抗性。抗產毒種質相對較少，只有4份，分別為抗黃曲霉產毒種質US26和低產毒花生品種Tifton-8、91322、91048，這類種質在黃曲霉菌侵染后可抑制毒素產生，該抗性與花生的種皮及胚有關系。花生對黃曲霉菌的侵染抗性和產毒抗性都具有降低黃曲霉毒素污染的作用。前人研究表明，抗侵染和抗產毒由相對獨立的抗性基因所控制，通過分子育種聚合多個抗病基因是解決花生黃曲霉毒素污染最為經濟有效的手段。

明確抗病資源的遺傳多樣性和親緣關系，發掘優良抗性種質，是培育抗病品種的基礎。但是，由于黃曲霉毒素污染問題的復雜性，尤其是缺乏經濟有效的抗性鑒定方法，導致花生抗性育種研究進展緩慢。因此，有必要采用新的技術對花生黃曲霉抗性進行篩選和鑒定，增強抗性鑒定結果的重復性、可靠性。分子標記技術的發展為花生抗黃曲霉育種提供了有力的研究手段。Hong等（2009）鑒定到5個和花生抗黃曲霉侵染高度相關的SSR標記，其中的標記pPGSseq19D9能區分所有的抗感品種；進而獲得了與包括百果重、含油量、蛋白含量、成熟莢果數、分枝數等11個表型性狀相關的特異DNA標記；還篩選到與控制種皮顏色的基因緊密連鎖的SSR標記PM93，二者的遺傳距離為5.4cM。本研究利用多態性SSR標記構建抗感黃曲霉及相關種質的指紋圖譜，鑒定抗性種質在分子水平的遺傳特征，為花生品種改良提供豐富的抗源材料，拓寬花生抗性育種的遺傳基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用國內外已鑒定并確認的48份抗感黃曲霉及相關花生種質（包括7份抗其它真菌和2份抗旱種質，見表1）為材料，每份材料選取3粒種子，水培至三片真葉出現，每株取一片小葉混合后加液氮研磨，CTAB法提取基因組DNA，稀釋至30ng/μL備用。

1.2 SSR標記檢測

利用前期已篩選的46對多態性高、條帶單一的多態性引物，分析48份抗感黃曲霉及相關花生種質的遺傳多樣性。10μL SSR-PCR反應體系包括1.5μL DNA，1.9μL ddH₂O，5μL2×Frements Mix，引物（10U）各0.8μL。反應程序為：95 qC預變性3 min；95qC變性45 s，55 qC退火45s，72℃延伸45s，35個循環；最后720C延伸5min。利用C1000 TouchrrM PCR儀（美國Bio-Rad公司）進行擴增。6%聚丙烯酰胺凝膠（29∶1）電泳在JY-JX5垂直電泳槽（北京君意東方儀器設備有限公司）上進行，1×TBE作電泳緩沖液，每孔加入PCR擴增產物2μL，電壓為200V，電泳時間根據片段大小確定。電泳結束后，銀染并顯影，白熾燈背景下拍照并保存。

1.3 數據統計方法

PCR擴增產物電泳結果以“0，1”方式統計，即在相同遷移位置上，有帶的賦值為1，無帶賦值為0，建立“0，1”數據陣。多態性信息含量（PIC）是表示微衛星序列變異程度高低的指標。式中，Pi、pj分別為群體中某SSR分子標記位點第i、j個等位變異的頻率，n為等位變異數。

2 結果與分析

2.1 SSR標記的遺傳多態性

46對SSR引物在48份材料中共擴增出237個等位變異，等位變異的范圍為2～8；等位變異數最多的SSR引物是AhITC2A02和AhlTC5D06，有8個；等位變異數最少的SSR引物是GM2165，只有2個；平均每對引物可擴增出5. 15個等位變異。PIC值為0.337～0.812，最高的是PM308，最低的是GM2165，平均PIC值為0.604（表2）。圖1、圖2為其中兩對SSR引物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。

46個SSR分子標記分布于23個不同的連鎖群上，LG13、LG14、LG19等1 1個連鎖群上分別只有1個，最多的LG6上分布有7個，其余有2～5個不等。不同連鎖群上SSR標記等位變異數不同，最少的LG21為3個，最多的LG6為34個。不同連鎖群SSR標記的平均多態性信息含量也不同，LG5連鎖群位點平均PIC最小，為0.419；LG9連鎖群位點平均PIC最大，為0.774（表2）。

2.2 48份抗感黃曲霉及相關花生種質的聚類分析

根據“0，1”數據構建48份花生種質的遺傳距離矩陣，利用“SHAN”進行聚類分析。結果表明，在遺傳距離為1.05處，48份種質被分成了8組（圖3）。其中91048為低產毒種質，與其它種質距離較遠，最先被分出來，單獨成一組；AR-1、AR-2中抗黃曲霉侵染種質為第二組；紅膜七十日早、蒲廟花生和石龍紅花生3份不抗旱種質為第三組；抗旱種質贛榆小站秧和萬安花生聚為第四組；低產毒的91322和抗黃曲霉侵染的新會小粒、ICGV94433、ICGV94434、ICGV87094、ICGV95440、ICGV94379以及ICGV92243聚為第五組；PI337409F單獨為第六組；抗黃曲霉侵染的AR-4、湛秋48和GFA-2，低產毒的US26、Tifton-8，抗其它真菌病害的Tiffrun-ner、CIl-2-39、C209-6-60、C724-25-22、C156-47、C76-16，抗圓柱狀黑腐病的PERRY以及感病種質泉花10號、香鄉聚為第七組，在遺傳距離為0.724處可以將抗黃曲霉相關種質AR -4、US26、Tifton-8（ A）與抗其它真菌病害的Tiffrunner等6個種質（B）以及國內種質（C）各自分組，并可將PERRY（E）和GFA-2（D）分別獨立出來；高感黃曲霉污染的金花1012、白沙1016、粵油92、瑤上大麻殼、茶杵豆與抗黃曲霉侵染種質AR-3、Celebes、CES48-30、GFA-1、J11、AH7223、UF71533-1、ICGV94435、PI337409、ICGV95435、ICGV95422、ICGV87110聚為第八組，在0.935處，可將抗感（H）種質完全分開，在0.916處，又可以將中抗黃曲霉侵染的AR-3（F）與其他高抗種質（G）分開。從以上分組可以看出，具有相同抗性特點的大部分種質都聚為一類，表明這些種質的遺傳背景是很相似的。

2.3 48份抗感黃曲霉及相關花生種質的指紋圖譜構建

從46個SSR標記中抽取5個標記共35個多態位點，可以將48份花生種質完全區分開來。這5個SSR標記分別為：AhlTC2A02（A）、AhlTC5D06（B）、STS20（C）、GNB556（D）和S093（E）。將35個多態性位點依次排序，把擴增產物的有無分別記為“l”和“0”，則可建立48份花生種質的計算機化的DNA指紋圖譜（表3）。

3 討論與結論

3.1 SSR標記在評價花生遺傳多樣性中的高效性

SSR分子標記具有高豐度、高多態性、共顯性遺傳、結果穩定、檢測技術簡單等特點，應用多態性SSR標記對具有優異基因種質的遺傳多樣性及其親緣關系進行評價，可以為抗病蟲、抗逆以及優質基因的精細定位及分子標記輔助選擇等研究奠定基礎。

本試驗采用46對多態性SSR引物進行擴增，平均每對引物可擴增出5.15個等位變異，平均PIC值為0.604，聚類結果與抗感黃曲霉花生種質的來源、抗性特點及遺傳背景非常一致，證明SSR標記是一種可靠的標記類型。聚類分析將AR-3、GFA-2、PERRY、PI337409F和91048分別獨立出來，說明這5個種質與其它種質存在較大的遺傳差異，可作為理想的育種材料，尤其是AR-3、GFA-2和PERRY株型較直立，果仁大而飽滿，符合高產優質這一當前育種要求，可作為雜交育種的親本，拓寬花生抗黃曲霉育種的遺傳基礎，實現種質的創新。

3.2 品種指紋圖譜

品種的指紋圖譜可以看作是該品種的“身份證”，將品種、引物名稱、分子數據等有序地整合在一起，形成每個品種唯一的識別代碼。SSR引物檢測到的位點相對較少，且特異性強，譜帶清晰，數據準確，適用于大量品種的鑒定分析。趙新燕等利用46對SSR引物構建了20份高油野生花生的數字分子指紋，選用了3組代碼，分別為國家統一編號、有效引物名稱、“0，1”字符串，通過這些DNA指紋圖譜，可以有效鑒定區分所有供試材料。劉冠明等應用SSR標記構建了20個南方花生主產區品種的指紋圖譜，僅用4對引物即可將19個品種相互區分開。王燕龍用23對SSR標記構建了144個花生栽培種的指紋圖譜，所用代碼為“引物代碼+十六進制字符串”。本試驗從46對SSR中抽取由5對標記所產生的35個多態位點，將48個抗感黃曲霉花生種質區分開來，建立了抗感病花生種質的“引物+0，l字符串”的指紋圖譜，為抗感黃曲霉花生種質資源的有效利用提供指導。