一株黑曲霉產纖維素酶培養基優化

任海霞 楊鵬 郭惠東 任鵬飛 李瑾 宮志遠

摘要：采用單因素試驗和正交試驗對黑曲霉FSDZH-l搖瓶發酵生產纖維素酶的營養條件進行優化。結果表明：其最佳培養基配方（g/L）為：玉米粉40.0，蛋白胨3.0，（NH₄）₂SO₄2.0，Na₂HPO₄0.5，MgSO₄0.2，FeS04·7H₂O0.1，CaCO₃0.5。在最佳培養基條件下，發酵液酶活力可達315.6U/mL。

關鍵詞：黑曲霉；纖維素酶；培養基；優化

中圖分類號：S182

文獻標識號：A

文章編號：1001-4942（2016）01-0067-04

纖維素是地球上分布最廣的碳水化合物，同時又是自然界中數量最大的可再生資源 。在工業、農業和生活廢料中，纖維素含量占有相當大的比重。我國是農業大國，每年產生農作物秸稈7億噸左右，目前這些秸稈通常被大量焚燒，不僅污染環境，而且浪費資源 。利用微生物降解纖維素因具有效率高、無污染、作用條件溫和、節約等優點而成為當前熱點之一，具有很大的應用潛力 。利用微生物處理纖維素其核心技術是優良的纖維素酶生產菌株及其產酶技術 。而產酶過程是非常復雜的生物化學反應過程，因此，研究菌體的代謝規律以及影響菌體產纖維素酶的各種營養因素和環境因素非常重要。本研究主要采用單因素試驗和正交試驗對影響產酶的各營養成分進行分析，以獲得黑曲霉產纖維素酶的最佳培養基。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）FSDZH-1，本實驗室保藏。

1.2 主要原料和試劑

小麥粉、玉米粉、玉米漿、豆粕粉、羧甲基纖維素鈉（美國Sigma公司），其它化學試劑。

1.3培養基及發酵條件

1.3.1 斜面培養基PDA培養基

1.3.2 初始產酶培養基 淀粉3g，Na₂HPO₂0.1g， NaNO₃0.5g，CaCO₃0.05g，MgSO₄0.015g，Fe-SO₄·7H₂O0.005g，水100mL，pH 7.0，121℃滅菌20min。

1.3.3 發酵條件將斜面菌種制成孢子懸液，接種于80mL基本培養基（500mL三角瓶）中，接種量為7.5×10⁴孢子/mL發酵液，30℃、200r/min搖瓶培養32h。

1.4 試驗方法

1.4.1 產酶培養基優化①單因素試驗：在初始培養基基礎上，依次以6種常見碳源（見表1）分別代替基礎培養基中的碳源、以常見的幾種無機氮源和有機氮源（見表2）代替基礎培養基中的氮源（添加量以N元素濃度相等為依據）以及不同濃度的MgS04、FeS04.7H20、CaCO。等無機鹽，進行單因素試驗，通過纖維素酶活力篩選最適碳源、氮源、無機鹽及相應的濃度。

②正交試驗：在單因素試驗確定的最適Mg-SO₄、FeSO₄·7H₂O、CaCO₃濃度基礎上選擇不同濃度的玉米粉、蛋白胨、（NH₄）₂SO₄、NaNO₃、Na₂HPO₄進行五因素四水平的正交試驗，試驗數據使用Latin正交軟件進行處理，通過纖維素酶活力確定該菌株產纖維素酶最佳培養基。

1.4.2 纖維素酶活力測定 取1.0%羧甲基纖維素鈉溶液1.8mL，50℃預熱5min，準確加入適當稀釋酶液200μL，在50℃水浴中準確反應30min，立即分別加入DNS試劑3mL，空白管中加入滅活酶液200μL，立即沸水浴10min，終止反應。冷卻后定容至25mL，于540nm波長下測定樣品管中OD值，通過DNS法測定還原糖含量，并對照標準曲線測算酶活力。

酶活力單位定義：在50℃反應條件下，每分鐘從濃度為1%的羧甲基纖維素鈉溶液中釋放1μmol還原糖所需要的酶量為一個活力單位（U）。

2 結果與分析

2.1 不同碳源物質對產酶的影響

試驗結果（表1）表明玉米粉是最佳碳源，發酵液酶活達到了108.90U/mL，小麥粉次之，淀粉作為碳源，發酵液的相對酶活力也達80%以上。而葡萄糖等低聚糖作為碳源產酶較低，可能是因為它們不需要胞外酶的水解就能被細胞直接利用，對纖維素酶的合成產生了阻遏作用。

2.2 不同氮源物質對產酶的影響

試驗結果（表2）表明，有機氮源的酶活普遍高于無機氮源，與孫旭東等結論相近。蛋白胨、玉米漿作為有機氮源時，發酵液都有較高酶活，而且無機和有機混合作為氮源，發酵液酶活力普遍高于單獨使用有機或無機氮源。（NH₄）₂SO₄和蛋白胨混合作為氮源時，發酵液酶活最高，達到了214.54U/mL，可能是因為（NH₄）₂SO₄中的NH4+是比較容易被微生物利用的“速效氮源”，而蛋白胨中氨基酸含量比較高，也是易被菌體吸收利用的長效氮源。

2.3 MgSO₄濃度對產酶的影響

對細胞來說，Mg²⁺是金屬離子中較為重要的一種。本研究在培養基中添加不同量的MgSO₄，檢測發酵液的酶活。圖1結果表明，MgSO₄最適濃度為0.2g/L，超過0.2g/L會抑制酶的活性。2.4FeSO₄·7H₂O濃度對產酶的影響

鐵是維持微生物代謝活動必需的微量元素之一。本研究在產酶培養基中添加不同濃度的FeSO₂·7H₂O，檢測發酵液酶活。圖2結果表明，FeSO₄·7H₂O的最適濃度為0.10g/L，Fe²⁺過量或不足都會影響發酵液酶活。

2.5 CaCO₃濃度對產酶的影響

鈣一般不參與微生物的細胞結構物質，但它是某些酶的激活劑，還可調節發酵液的pH值，而且鈣離子能調節細胞透性，對纖維素酶也有一定的激活作用。圖3結果可以看出，CaCO₃的最適濃度0.5g/L。

2.6 正交試驗確定最佳培養基配方

前面分析了培養基中各單因素對產酶的影響，但在產酶過程中往往各個因素之間還有較大的影響，因此需要對各因素進行綜合考察確定最佳產酶條件，尤其是選擇合適的碳、氮源濃度及碳氮比對菌株的生長和產酶有直接關系。通過正交試驗既可以確定合適的碳氮比和碳、氮源濃度，也可以從多個因素中分析主次，分析各因素對產酶的影響規律，還可以考察各個因素的相互作用對產酶的影響，從而得出最佳產酶條件。

由表3可知，玉米粉濃度是影響最顯著的因素，玉米粉濃度在40.0g/L以下時，發酵液酶活力隨小麥粉濃度的增大而增大，玉米粉濃度大于40.0g/L時，發酵液酶活力不再增長，主要是因為初始糖濃度太高影響了溶氧，而且也抑制了菌體生長，因而影響了產酶。五個因素對發酵產酶的顯著性依次為A>B>C>E>D，最佳條件分別為A₃B₂C₂D₁E₂，即最適濃度（g/L）為玉米粉40，蛋白胨3.0，（NH₄）₂SO₄2.0，NaNO₃0，Na₂HPO₄0.5。按培養基配方（g/L）為玉米粉40.0，蛋白胨3.0，（NH₄）₂SO₄2.0，NaNO₃0，Na₂HPO₄0.5， MgSO₄0.2，FeSO₄·7H₂O0.1，CaCO₃0.5進行驗證試驗，發酵液纖維素酶活力315.60U/mL，每毫升發酵液比處理10高出9.24U。

3 結論與討論

通過對黑曲霉FSDZH-1產纖維素酶培養基的研究，得出最佳培養基為（g/L）：玉米粉40.0，蛋白胨3.0，（NH₄）₂SO₄2.0，Na₂HPO₄0.5，MgSO₄0.2，FeSO₄·7H₂O0.1，CaCO₃0.5。每毫升發酵液酶活力達315.6U，而且黑曲霉的酶系比較豐富，有進一步深入研究進而實現工業化生產的潛力。但是搖瓶發酵工藝和大罐發酵工藝還不盡相同，如果擴大生產，還需要在搖瓶發酵的基礎上進一步優化發酵罐工藝，以獲得最佳生產參數。