花生突變體的誘導(dǎo)與篩選利用

侯蕾 付春 夏晗 趙術(shù)珍 魯成凱 趙傳志 姜言生 王興軍

摘要：利用誘變創(chuàng)新種質(zhì)材料是作物遺傳改良和功能基因組學(xué)研究的重要途徑。本研究以豐花l號、山花13號、濰花10號等10個主要推廣的栽培花生品種為材料，利用EMS、印60Coγ射線、快中子輻射三種方法對成熟種子進行誘變處理，獲得了一個含有30000多個M1代單株的誘變?nèi)后w。對M2代突變體進行田間觀察和近紅外分析，初步篩選得到多份在葉、株型、莢果、種子發(fā)育等方面發(fā)生明顯變異的材料。將具有明顯性狀變異的M2代突變體進行種植繁育獲得M3代，進一步鑒定其表型變異的穩(wěn)定性。這些材料的獲得為花生遺傳改良和功能基因鑒定提供了豐富的試驗材料。

關(guān)鍵詞：花生；突變體；EMS；60Coγ射線；快中子輻照；種質(zhì)資源

中圖分類號：S565.203.52

文獻標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2016）01-0011-05

花生是重要的油料和經(jīng)濟作物，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高抗花生新品種對提高花生產(chǎn)值、增加農(nóng)民收益有著重要意義。我國花生栽培種的遺傳基礎(chǔ)異常狹窄，當(dāng)前推廣的花生品種大多含有伏花生和獅頭企的血緣，這在很大程度上限制了利用現(xiàn)有花生種質(zhì)進行遺傳改良的效果。通過射線、EMS等手段誘發(fā)基因發(fā)生變異，根據(jù)育種目標(biāo)對這些變異進行篩選和鑒定，并在此基礎(chǔ)上培育出新的種質(zhì)材料和品種，拓展花生遺傳背景，是改變這種現(xiàn)狀的有效途徑。近年來，直接利用突變體選育新品種或?qū)⑼蛔凅w作為親本材料進行雜交獲得的新品種數(shù)量逐年增加，在花生、秈稻、小麥、大豆等多種農(nóng)作物中均有應(yīng)用。物理和化學(xué)方法誘發(fā)突變具有操作簡單、變異率高等特點，突變性狀通常穩(wěn)定較快，可縮短育種周期。

突變體是克隆鑒定基因、研究基因功能最直接有效的材料，突變體的獲得及分析在高等植物基礎(chǔ)理論研究中發(fā)揮重要作用。例如擬南芥det2、dwfl和bril突變體表現(xiàn)出植株矮小、葉色暗綠、葉片上卷、發(fā)育延遲等性狀，通過對這些突變體的研究闡明了油菜素內(nèi)酯（BR）合成途徑中關(guān)鍵酶和BR受體的功能，揭示了BR合成與信號傳導(dǎo)通路在植物正常生長發(fā)育過程中的重要性。通過篩選分析番茄抗病性突變體，闡明了NRCl（NB-LRR protein required for HR-asso-ciated cell death l）蛋白在番茄葉霉菌抗性方面的重要作用。

輻射誘變是創(chuàng)制花生突變體的重要手段，主要誘變因子有60Coγ射線、離子束、激光等，快中子、32p照射等在花生誘變研究上也有所應(yīng)用。60Coγ射線輻射是最常用的誘變方法，花育32號和花育22號均是采用60Coγ射線誘變處理育種材料，然后與優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的品系雜交，經(jīng)系譜法選育而成。EMS作為誘變劑在花生誘變育種研究中也有報道。王傳堂等將EMS注入花育16號和魯花11號的花器進行誘變，成功獲得了單株結(jié)果數(shù)、單株仁重、飽果率比對照有明顯提高的突變體。多項研究證明快中子輻照在花生品質(zhì)改良中具有一定的潛力，可以作為花生育種的一種輔助手段。

本研究利用EMS、60Coγ射線、快中子輻射三種方法獲得了一個較大的花生突變體群體，初步篩選到多份在植株生長發(fā)育方面發(fā)生明顯變異的材料，獲得含油量、蛋白含量、油亞比發(fā)生明顯變化的優(yōu)良突變材料。這些材料的獲得不僅為花生遺傳改良提供了新的種質(zhì)資源，也為花生功能基因的克隆鑒定提供了重要材料，對利用生物技術(shù)手段改良花生具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用生產(chǎn)上廣泛種植的花生良種豐花1號、山花13號、花育22號、花育23號、花育36號、濰花10號、濰花12號、濰花16號、魯花1 1號、開農(nóng)1715共10個花生品種用于突變體的創(chuàng)制，材料由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心保存。對照與處理后的花生種子種植在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心飲馬泉試驗基地和濟陽、東營、日照花生種植基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 誘變方法根據(jù)前人研究結(jié)果設(shè)定EMS處理溶液的濃度、60Coγ射線和快中子輻照的劑量。

60Coγ射線輻射處理：設(shè)置60Coγ射線300、500、1000Gy三種劑量輻照花生干種子，以不輻射處理作對照。輻射處理在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所進行。

快中子輻射處理：選擇顆粒飽滿的種子，輻照能量為14.OMeV，輻照劑量為14.0Gy，以不輻照種子為對照。輻照處理在中國原子能科學(xué)研究院進行。

EMS誘變處理：純水浸泡種子約10h，用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液配制0.2%的EMS誘變液，將泡好的種子倒人誘變液中，黑暗浸泡8h，每隔30min搖動一次。誘變液處理完后用水沖洗種子5次，每次20min。將誘變液和沖洗的廢水與等體積0.5mol/L硫代硫酸鈉溶液混合以去除毒性，倒掉廢液。保持種子濕潤透氣，及時播種。對照用純水浸泡。

1.2.2 突變體性狀觀察與鑒定在花生出苗期、營養(yǎng)生長期、開花期和收獲期對M2代株系的株高、葉色、葉形、開花情況、分枝數(shù)量、果針發(fā)育等性狀進行考察，收獲后對莢果大小、果仁大小、莢果產(chǎn)量、出仁率等性狀進行調(diào)查分析。

1.2.3 突變體種子不同成分檢測 種子蛋白質(zhì)、脂肪酸等不同成分檢測采用近紅外光譜分析法，儀器型號為DA 7250（Perten，Sweden）。以未誘變親本為對照進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生突變體創(chuàng)制過程

2013年，利用60Coγ射線300、500Gy兩個劑量輻照花育22號、花育23號、花育36號、濰花12號、濰花16號、魯花11號6個花生品種，種植后對M1代進行單株收獲，得到含有8000余單株的M1代突變?nèi)后w。同年利用0.2%的EMS溶液誘變處理豐花1號種子，收獲M1代突變體單株2000多株。

2014年，利用濃度為0.2%的EMS溶液誘變處理山花13號和濰花10號，收獲M1代單株3350株。同年，利用60Coγ射線500、1000 Gy兩個劑量輻照山花13號，共收獲M1代單株約10000株。另外，利用14.0Gy劑量的快中子誘變山花13號、濰花10號和開農(nóng)1715，獲得M1代單株約4800株。

在2014年和2015年分別將約10000份M1代種子播種，對M2代群體表型進行調(diào)查記錄，將具有明顯性狀變異的M2代突變體進行種植繁育獲得M3代，將其中的143份M3代突變體種子播種以進行表型驗證，其余種子放人冷庫保存。

2.2 葉片形態(tài)突變體的篩選

誘變處理對部分M，代突變體的葉色、葉形和葉片大小等產(chǎn)生了顯著影響。篩選到的突變體有的葉片顏色較深、葉柄變短、葉片較小（圖la）；有的葉片發(fā)生不同程度的卷曲、皺縮（圖lb、d）；有的葉片黃化（圖lc）；有的葉型明顯細(xì)窄，葉片小、顏色發(fā)黃（圖le）；有的植株異常矮小，葉片細(xì)小（圖lf）。

2.3 植株形態(tài)突變體的篩選

在植株高度、分枝數(shù)、匍匐形態(tài)等方面發(fā)生變異的突變體很多。有的突變體株高明顯高于親本（圖2a），突變體H22-30高度大約為67cm，而對照親本花育22大約為40cm；有的植株表現(xiàn)矮化（圖2b），突變體H36-10高度僅為15cm，明顯低于對照親本；有的突變體分枝數(shù)目增多，果莢數(shù)目也有所變化（圖2c、d）；有的植株形態(tài)從直立型變成了匍匐型（圖2e）。

2.4 莢果與種子相關(guān)突變體的篩選

誘變處理也產(chǎn)生了大量莢果和種子發(fā)生變異的突變體，例如有的突變體果型發(fā)生變化，腰型變粗，大多果莢只有一粒種仁（圖3a）；有些種子大小發(fā)生變化（圖3b、c），突變體4H23-15種子質(zhì)量約是其對照親本的0.69倍，而2W12-20大約是其對照親本的1.28倍；有的種子種皮部分發(fā)紫或產(chǎn)生紫色斑點（圖3d、e），或種皮開裂（圖3f）。

2.5 種子成分突變體的篩選

利用近紅外分析儀對花生突變體M2代單株種子中蛋白質(zhì)、油酸、亞油酸含量和含油量進行測定，初步篩選得到蛋白、油酸、亞油酸等儲藏物質(zhì)含量與未誘變親本相比有明顯差異的突變體100多份，其中突變體LH11-502的含油量最高，達61.57%；HY36-528的蛋白質(zhì)含量最高，為36.17%；WH12-2059的油酸含量最高，油亞比達到61.37（表1）。

3 結(jié)論與討論

花生富含植物油脂和蛋白質(zhì)，營養(yǎng)豐富，易被人體消化吸收。姜慧芳等檢測了國內(nèi)外4000多份花生種質(zhì)材料，結(jié)果表明這些材料的平均含油量為50.57%，最高含油量為60.21%，90%以上花生品種的含油量在46%～56%之間。本研究篩選到多份含油量在58%以上的突變體材料，其中LH11-502的含油量遠(yuǎn)超過現(xiàn)有的種質(zhì)材料，這些突變體的獲得對于花生遺傳改良提高含油量具有重要意義。

目前大面積種植的花生品種一般用作榨油，蛋白質(zhì)含量偏低（26%左右），而鮮食花生品種考核指標(biāo)要求蛋白質(zhì)含量在30%以上。本研究篩選到多個蛋白質(zhì)含量在31%以上的突變體，是培育鮮食花生的重要候選材料。

油酸是影響花生油理化穩(wěn)定性和營養(yǎng)價值的重要品質(zhì)指標(biāo)。近年來，我國開始注重高油酸花生育種，并已經(jīng)育成一些高油酸花生新品種，如開農(nóng)61、花育32號、花育51號、開農(nóng)H03-3、冀花11號等。但我國目前高油酸花生品種類型仍不夠豐富，多為小果型，種植面積很小，且其親本來源較局限，依賴于早期鑒定的極少數(shù)高油酸花生突變體。本研究獲得的高油酸突變體中有7份材料的油亞比超過12：1，其中有些突變體還具有含油量高、產(chǎn)量高等特點。這些材料的獲得拓寬了花生高油酸品種材料的范圍，將有助于深刻闡明花生高油酸形成的分子機理，同時為今后培育新的高油酸品種及拓展其遺傳多樣性具有重要意義。

構(gòu)建飽和的基因突變?nèi)后w是分析鑒定基因功能最有效的方法之一，本研究篩選到的植株發(fā)育相關(guān)、種子品質(zhì)相關(guān)的突變體，為花生功能基因組學(xué)的研究打下了良好的基礎(chǔ)。本課題組還為花生突變體建立了信息檔案，對每個突變體的表型、理化分析數(shù)據(jù)以及遺傳分離比等信息做了詳細(xì)的記錄。突變體信息數(shù)據(jù)庫的建立將促進花生突變體在不同研究團隊間的材料交換與信息交流。