葡萄糖氧化酶和細胞色素C對鹽生杜氏藻細胞密度及β—胡蘿卜素積累的影響

劉偉 王婷 馮佳 呂俊平 劉琪 謝樹蓮

摘要：為了解外源物質(zhì)對鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）生長和β-胡蘿卜素積累的影響，本試驗以分離自運城鹽湖的一株鹽生杜氏藻（D.salina YCOI.）為材料，在培養(yǎng)基中添加外源葡萄糖氧化酶和細胞色素C，研究其對鹽生杜氏藻細胞密度和p一胡蘿卜素含量的影響。結(jié)果表明，葡萄糖氧化酶濃度9mg/L、細胞色素C濃度lμmol/L時，鹽生杜氏藻細胞密度和β-胡蘿卜素含量同時最大，因此，為兩種外源物質(zhì)的最優(yōu)添加濃度。

關鍵詞：鹽生杜氏藻；葡萄糖氧化酶；細胞色素C；細胞密度；β-胡蘿卜素

中圖分類號：S555⁺.6

文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）01-0040-04

β-胡蘿卜素（β-Carotene）呈橙黃色，分子式為C40 H56，廣泛存在于植物及真菌中，被認為是一種重要的抗癌物質(zhì)，具有抗氧化、增強免疫、防治心血管疾病、抗輻射和光敏損傷以及轉(zhuǎn)化為維生素A等作用，對放療產(chǎn)生的副作用有一定的減緩功效。β-胡蘿卜素還被世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會認定為A類營養(yǎng)色素，在全世界50多個國家和地區(qū)作為食品添加劑和著色劑使用。

鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）是一種單細胞嗜鹽藻類，也是一種重要的經(jīng)濟藻類。它是生產(chǎn)β-胡蘿卜素的天然資源，其合成和積累的β-胡蘿卜素可高達干重的14%，具有良好的市場前景。鹽生杜氏藻的培養(yǎng)及β-胡蘿卜素的積累機理在20世紀90年代前后就有報道。之后，鹽生杜氏藻培養(yǎng)的關鍵技術及影響因素、二步培養(yǎng)法等陸續(xù)報道。我國也有關于鹽生杜氏藻培養(yǎng)方面的研究報道。章麗等從鹽生杜氏藻中克隆了影響β-胡蘿卜素積累的關鍵酶β-胡蘿卜素羥化酶基因，并對其進行表達分析，研究其對β-胡蘿卜素合成的調(diào)控作用。

有報道稱添加外源葡萄糖氧化酶和細胞色素C可促進β-胡蘿卜素的積累，但其對鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素合成的影響尚未見報道。本試驗以分離自山西運城鹽湖的一株鹽生杜氏藻為材料，通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度的葡萄糖氧化酶和細胞色素C，研究其對細胞密度和β-胡蘿卜素合成的影響，以期為優(yōu)化培養(yǎng)條件、最大限度獲取β-胡蘿卜素提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

試驗所用鹽生杜氏藻藻種（Dunaliella salinaYC01.）分離自山西省運城鹽湖。

培養(yǎng)基為Dunaliella培養(yǎng)基，pH 7.5，光照強度20000 lx，溫度（25±1）℃，光周期16h：8h，每日搖動數(shù)次。

試驗所用試劑均為分析純。試驗所用儀器主要有光照培養(yǎng)箱（SPX-250B-G，上海博訊）；紫外可見分光光度計（752PC，上海光譜）；生物顯微鏡（SK200，麥克奧迪）；全自動制冰機（IMS-30，常熟雪科）；超聲波細胞粉碎機（SCIENTZ-IID，寧波新芝）；高速冷凍離心機（HC-2518R，中科中佳）。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄糖氧化酶濃度優(yōu)化初步優(yōu)化：設置7個葡萄糖氧化酶濃度梯度，分別為0、2、5、8、12、16、20mg/L。每個梯度設置3個重復。培養(yǎng)14d后測定細胞密度和β-胡蘿卜素含量。

精細優(yōu)化：以初步優(yōu)化結(jié)果為依據(jù)，加入由初步優(yōu)化得到的最佳葡萄糖氧化酶濃度范圍，設置5個濃度梯度，每個梯度設置3個重復。培養(yǎng)14d后測定細胞密度和β-胡蘿卜素的含量。

1.2.2 細胞色素C濃度篩選 根據(jù)上一步試驗結(jié)果，加入葡萄糖氧化酶最佳濃度，再加入細胞色素C，設置4個濃度梯度，分別為0、1、2、3卜Lmol/L。每個梯度設置3個重復。培養(yǎng)14d后測定細胞密度和β-胡蘿卜素的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別采用PASW Statistics 18.O、Oringin 8.0以及Photoshop CS5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析和做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖氧化酶濃度的初步優(yōu)化

從圖1可以看出，在試驗范圍內(nèi)，當葡萄糖氧化酶濃度較低時（≤8mg/L），鹽生杜氏藻細胞密度隨著葡萄糖氧化酶濃度的升高而升高，但是當葡萄糖氧化酶濃度較高時（≥8mg/L），鹽生杜氏藻細胞密度隨著葡萄糖氧化酶濃度的升高而下降，細胞密度最高范圍出現(xiàn)在葡萄糖氧化酶濃度8-12mg/L之間。

從圖2可以看出，在試驗范圍內(nèi)，葡萄糖氧化酶對鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素含量的影響與細胞密度變化趨勢一致。當葡萄糖氧化酶濃度較低時（≤8mg/L），鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素含量隨著葡萄糖氧化酶濃度的升高而升高，但是當葡萄糖氧化酶濃度較高時（≥8mg/L），鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素含量隨著葡萄糖氧化酶濃度的升高而下降，β-胡蘿卜素含量最高范圍也出現(xiàn)在葡萄糖氧化酶濃度8～12mg/L之間。

2.2 葡萄糖氧化酶濃度的精細優(yōu)化

精細優(yōu)化是以初步優(yōu)化的結(jié)果為依據(jù)，設置5個濃度梯度，分別為8、9、10、II、12mg/L。

從圖3可知，在設置的葡萄糖氧化酶濃度梯度范圍內(nèi)，鹽生杜氏藻的細胞密度雖有一些波動，但無顯著性差異。

從圖4可以看出，在設置的葡萄糖氧化酶濃度梯度范圍內(nèi)，鹽生杜氏藻的β-胡蘿卜素含量有一定差異，當濃度為9mg/L時，β-胡蘿卜素含量最高，且相對其它處理有顯著性差異。

綜合鹽生杜氏藻細胞密度和β-胡蘿卜素含量的研究結(jié)果，葡萄糖氧化酶的最優(yōu)濃度為9mg/L。

2.3 細胞色素C對鹽生杜氏藻細胞密度和β-胡蘿卜素含量的影響

從圖5可以看出，與對照相比，添加外源細胞色素C可使鹽生杜氏藻細胞密度增加，且呈顯著性差異；但各處理間，鹽生杜氏藻細胞密度無顯著性差異。

從圖6可以看出，細胞色素C對鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素的含量有影響。當細胞色素C濃度為1μmol/L時，β-胡蘿卜素含量顯著高于其它處理。

綜合上述，適宜鹽生杜氏藻生長和β-胡蘿卜素積累的最佳細胞色素C濃度為1μmol/L。

3 討論與結(jié)論

在β-胡蘿卜素合成代謝途徑中，β-胡蘿卜素羥化酶是體系的關鍵酶，它能以β-胡蘿卜素為底物，催化生成玉米黃質(zhì)。β-胡蘿卜素羥化酶是一種非血紅素雙鐵單加氧酶，其作用機制為通過獲得光合電子傳遞鏈中鐵氧還蛋白傳遞的電子，在含鐵的酶活性中心利用活化的分子氧去打斷該酶的相關化學鍵而起作用。β-胡蘿卜素羥化酶的活化嚴格依賴分子氧的存在并以鐵氧還蛋白為電子供體，因此尋找該酶的活性抑制劑，調(diào)控相關過程，對促進鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素的積累非常重要。

研究表明，葡萄糖能夠誘導藻類和植物體β-胡蘿卜素羥化酶基因的表達，因而不利于β-胡蘿卜素的積累。有氧條件下，葡萄糖氧化酶專一性地催化β-D-葡萄糖等底物的降解，進而下調(diào)β-胡蘿卜素羥化酶基因的表達。同時，該催化反應發(fā)生時消耗分子氧使體系中的活性氧分子甚至是氧原子減少，進而抑制β-胡蘿卜素羥化酶的活性。因此，葡萄糖氧化酶的存在有利于β-胡蘿卜素的積累。

細胞色素C屬于線粒體內(nèi)膜呼吸鏈上的傳遞蛋白，從細胞色素C還原酶接受電子傳遞給細胞色素C氧化酶。外源細胞色素C能夠?qū)⒐夂献饔眠^程中由鐵氧還蛋白傳遞給β-胡蘿卜素羥化酶的電子轉(zhuǎn)移，使其得不到電子而失去相應的活性，因而可以對相關底物起到保護作用。

本試驗即通過轉(zhuǎn)移電子和適度去除培養(yǎng)體系中的活性分子氧進而抑制β-胡蘿卜素羥化酶的活性，以達到增加β-胡蘿卜素積累的目的。從試驗結(jié)果看，當葡萄糖氧化酶濃度為9mg/L、細胞色素C濃度為lμmol/L時，鹽生杜氏藻的生長和β-胡蘿卜素積累效果最佳，為該藻的大量培養(yǎng)提供一定參考。