雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人維生素D受體的方法學(xué)構(gòu)建

喻妙梅，于洋，張俊，姚霜，潘麗莉，羅光華

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雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人維生素D受體的方法學(xué)構(gòu)建

喻妙梅，于洋，張俊，姚霜，潘麗莉，羅光華△

摘要：目的建立單管檢測(cè)人維生素D受體（VDR）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因的雙重實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（dual real-time PCR）的方法。方法以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物及TaqMan探針，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)VDR基因。將VDR及GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物片段純化后克隆構(gòu)建成重組質(zhì)粒，作為定量檢測(cè)基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)品，并用于分析該方法的靈敏度和重復(fù)性。結(jié)果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析證實(shí)為VDR及GAPDH特異性片段；該方法檢測(cè)VDR與GAPDH靈敏度達(dá)40拷貝/μL；線性范圍為4.00×101～4.00×105拷貝/μL；決定系數(shù)R2分別為0.998、0.999；擴(kuò)增效率E分別為96.10%、85.15%；批內(nèi)變異系數(shù)（CV）分別為0.09%～ 1.21%、0.35%～0.88%；批間CV分別為0.17%～0.51%、0.51%～2.46%。結(jié)論成功建立了單管檢測(cè)人VDR及GAPDH的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，且該方法特異性好、靈敏度高、可快速高通量檢測(cè)VDR的相對(duì)表達(dá)量，有效縮短時(shí)間，減小實(shí)驗(yàn)誤差。

關(guān)鍵詞：受體，骨化三醇；聚合酶鏈反應(yīng)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶類；維生素D受體；雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR

△通訊作者E-mail：shineroar@163.com

維生素D受體（vitamin D receptor, VDR）為親核蛋白，是介導(dǎo)1,25-(OH)2D3發(fā)揮生物效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子，屬于類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員。VDR廣泛分布于人體各組織細(xì)胞中，其中結(jié)腸、腎臟、骨骼等部位及淋巴細(xì)胞中的表達(dá)尤為顯著[1]。VDR是一種配體依賴的核轉(zhuǎn)錄因子，主要通過(guò)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄而調(diào)控蛋白合成。它在維持機(jī)體礦物質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡、鈣磷代謝、骨代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和免疫等方面起重要作用[2]。因單熒光實(shí)時(shí)定量PCR在檢測(cè)多個(gè)基因時(shí)需要多管反應(yīng)體系，試劑耗費(fèi)多且耗時(shí)長(zhǎng)。另外，在定量研究靶基因表達(dá)水平時(shí)，必須有內(nèi)參基因，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）基因的參與，通過(guò)靶基因與內(nèi)參基因表達(dá)量的比來(lái)消除標(biāo)本間RNA提取時(shí)的取樣誤差。如果用單熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)靶基因和內(nèi)參基因，需要分兩管進(jìn)行，會(huì)在模板（cDNA）加樣環(huán)節(jié)產(chǎn)生加樣誤差。為避免此誤差并減少PCR次數(shù)，本研究構(gòu)建了單管檢測(cè)VDR及GAPDH基因表達(dá)的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR（dual real-time PCR）的方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀（Light Cycler 480Ⅱ，Roche公司），核酸蛋白測(cè)定儀（Eppendorf公司），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（5804R，Eppendorf公司），脂肪組織總RNA提取試劑盒（QIAGEN公司），cDNA首鏈合成試劑盒（Thermo Fisher公司），Immolasetm DNA Polymerase（Bioline公司）。

1.2方法

1.2.1引物及探針的設(shè)計(jì)與合成在GenBank中查找VDR （NM_001017535）和GAPDH（NM_001289745）的堿基序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物及TaqMan探針，引物和探針序列均委托生工生物工程（上海）有限公司合成，見(jiàn)表1。

1.2.2脂肪組織總RNA制備取剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦腹部皮下脂肪組織約黃豆大小（約0.1 g，來(lái)源于常州市婦幼保健院），按脂肪組織總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取分離總RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)吸光度（A260 /280 nm），計(jì)算RNA濃度及純度。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR擴(kuò)增取A260 /280 nm在1.8～2.0之間的標(biāo)本，參照cDNA首鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（-20℃保存）。所有PCR均在Light Cycler 480Ⅱ型熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行克隆測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒用于制備標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4VDR/GAPDH混合質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確的重組質(zhì)粒經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)濃度，選取1×106拷貝/μL數(shù)量級(jí)的VDR和GAPDH質(zhì)粒等比例混合作為標(biāo)準(zhǔn)品原液，將標(biāo)準(zhǔn)品原液10倍梯度稀釋成1×101～1×106拷貝/μL數(shù)量級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)品，依次作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.5雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件優(yōu)化PCR總反應(yīng)體系為25 μL，其中VDR/GAPDH混合質(zhì)粒4 μL，10× ImmoBuffer 2.5 μL，50 mmol/L MgCl22 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，1 mmol/L ASETM熱啟動(dòng)酶0.5 μL，100 μmol/L VDR及GAPDH正、反義引物和探針均為0.04 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃5 s，60℃15 s（溫度轉(zhuǎn)換率均為20℃/s），擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；40℃1 min。60℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào)。檢測(cè)通道分別為FAM通道（465～510 nm，VDR）和CY5通道（618～660 nm，GAPDH）。結(jié)果判斷：在陰性對(duì)照成立條件下，Ct值≤35 HU時(shí)，PCR擴(kuò)增有效；Ct值≥40 HU時(shí)檢測(cè)結(jié)果為陰性；Ct值在35～40 HU時(shí)，建議復(fù)檢。

1.2.6雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度和重復(fù)性試驗(yàn)每個(gè)樣品重復(fù)5個(gè)批次（批間重復(fù)），每個(gè)批次重復(fù)5個(gè)復(fù)孔（批內(nèi)重復(fù)），根據(jù)臨界循環(huán)數(shù)以及模板起始拷貝數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)方程。根據(jù)得到的Ct值計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)（CV），驗(yàn)證該方法的批內(nèi)及批間重復(fù)性。

2　結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒序列分析PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖1，將VDR和GAPDH重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果分別與其各自基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示其符合率為100%。

2.2VDR/GAPDH擴(kuò)增曲線及靈敏度分析VDR基因在FAM通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，見(jiàn)圖2A。GAPDH基因在CY5通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，見(jiàn)圖2B。VDR和GAPDH混合質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)10倍連續(xù)稀釋（4×101～4×105），按上述條件進(jìn)行熒光定量RT-PCR，結(jié)果表明，該法對(duì)檢測(cè)人VDR和GAPDH基因靈敏度均為4×101拷貝/μL。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及線性檢測(cè)范圍人VDR和GAPDH基因雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：=-3.419 X+39.40（圖3A）、=-3.738 X+ 40.51（圖3B），其中Y代表Ct值，X代表模板量的對(duì)數(shù)值。其線性范圍為4×101～4×105拷貝/μL；決定系數(shù)R2分別為0.998、0.999；擴(kuò)增效率E分別為96.10%、85.15%。

Tab. 1 Primer and probe sequences of VDR/GAPDH表1　VDR/GAPDH引物及探針序列

Fig.1 The analysis of recombinant plasmid sequence圖1　重組質(zhì)粒序列分析

Fig. 2 Amplification curves of human VDR/GAPDH detected by dual real-time fluorescence quantitative PCR assay圖2　雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)人VDR/GAPDH擴(kuò)增曲線

2.4VDR/GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品的重復(fù)性分析VDR和GAPDH批內(nèi)變異系數(shù)分別為0.09%～1.21%、0.35%～ 0.88%，具有較好的批內(nèi)重復(fù)性，見(jiàn)表2。VDR和GAPDH批間變異系數(shù)分別為0.17%～0.51%、0.51%～ 2.46%，具有較好的批間重復(fù)性，見(jiàn)表3。

Fig.3 Standard curves of human VDR/GAPDH detected by dual real-time fluorescence quantitative PCR assay圖3　雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)人VDR/GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Tab. 2 Intra-batch repeatability of VDR/GAPDH standards表2　VDR/GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)重復(fù)性（n=5,±s）

Tab. 2 Intra-batch repeatability of VDR/GAPDH standards表2　VDR/GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)重復(fù)性（n=5,±s）

標(biāo)準(zhǔn)品4.0×1054.0×1044.0×1034.0×1024.0×101VDR±s(拷貝/μL) 19.16±0.08 22.53±0.07 25.97±0.07 29.29±0.03 32.66±0.40 CV(%) 0.43 0.31 0.26 0.09 1.21 18.75±0.16 23.33±0.21 27.41±0.15 31.83±0.11 35.24±0.16 GAPDH±s(拷貝/μL)　CV(%) 0.86 0.88 0.56 0.35 0.45

Tab. 3 Inter-batch repeatability of VDR/GAPDH standards表3　VDR/GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品的批間重復(fù)性（n=5,±s）

Tab. 3 Inter-batch repeatability of VDR/GAPDH standards表3　VDR/GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品的批間重復(fù)性（n=5,±s）

標(biāo)準(zhǔn)品4.0×1054.0×1044.0×1034.0×1024.0×101VDR±s (拷貝/μL) 18.99±0.09 22.32±0.04 25.69±0.08 29.03±0.08 32.41±0.17 CV（%）0.48 0.17 0.31 0.27 0.51 18.66±0.09 23.04±0.57 26.95±0.55 31.27±0.77 34.63±0.56 GAPDH±s (拷貝/μL)　CV（%）0.51 2.46 2.03 2.45 1.61

3　討論

VDR具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的作用，并參與機(jī)體免疫和代謝調(diào)節(jié)[3]。VDR主要通過(guò)介導(dǎo)1,25-(OH)2D3發(fā)揮生物效應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，1,25-(OH)2D3可誘導(dǎo)外周單核細(xì)胞分化成吞噬細(xì)胞，誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞，進(jìn)而加快骨吸收[4]。VDR在免疫系統(tǒng)方面的調(diào)節(jié)主要表現(xiàn)為能夠加強(qiáng)先天免疫[5]。此外，VDR還可以介導(dǎo)1,25-(OH)2D3抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化[6]。有研究報(bào)道，VDR基因敲除小鼠的耗氧量和產(chǎn)生CO2的量都顯著高于野生型小鼠[7]，此結(jié)果提示VDR可能與能量代謝有關(guān)。因此，檢測(cè)VDR mRNA的表達(dá)對(duì)深入研究其病理和生理功能及作用機(jī)制有非常重要的意義。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR把擴(kuò)增、分子雜交、酶動(dòng)力學(xué)和光化學(xué)巧妙地結(jié)合在一起，克服了傳統(tǒng)PCR的缺點(diǎn)，使PCR處于全封閉條件下進(jìn)行，并通過(guò)計(jì)算機(jī)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，與傳統(tǒng)終末法PCR相比具有靈敏度高、特異性好和反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)[8]。但是，單熒光通道實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)多種基因RNA表達(dá)水平，需配制多管體系（如靶基因和內(nèi)參基因），存在耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高的缺點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，VDR與GAPDH檢測(cè)靈敏度均較高，最低檢測(cè)限為101數(shù)量級(jí)，線性范圍廣，在1×101～1×105拷貝/μL范圍內(nèi)具有良好線性，擴(kuò)增效率高，批內(nèi)及批間重復(fù)性較好。

該方法實(shí)現(xiàn)了一次加樣同時(shí)檢測(cè)靶基因和內(nèi)參基因的目的，有效避免了兩次PCR間起始模板的加樣誤差，可以更精確地研究靶基因的相對(duì)表達(dá)水平。同時(shí)，該方法還有效克服了單熒光通道PCR的缺點(diǎn)，無(wú)需增加特殊試劑和材料，顯著簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)程序，縮短了檢測(cè)周期并降低了實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，可以比較準(zhǔn)確地測(cè)定人VDR基因的表達(dá)，具有高效、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定和準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，成為深入探討VDR病理和生理功能及作用機(jī)制有效的方法。

參考文獻(xiàn)

[1] Gonzalez-Parra E, Rojas-Rivera J, Tunon J, et al. Vitamin D recep?tor activation and cardiovascular disease [J]. Nephrol Dial Trans?plant, 2012, 27(Suppl 4):iv17-21. doi: 10.1093/ndt/gfs534.

[2] Gao L, Tao Y, Zhang L, et al. Vitamin D receptor genetic polymor?phisms and tuberculosis: updated systematic review and meta-anal?ysis [J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2010, 14 (1):15-23.

[3] Cui J, Chen H, Huang BR. The recent progress in the studies of vita?min D receptor [J]. Progress in Physiological Sciences, 2011, 42 (2): 95-99. [崔健,陳虹,黃秉仁.維生素D受體最新研究進(jìn)展[J].生理科學(xué)進(jìn)展, 2011, 42 (2):95-99].

[4] Pike JW, Lee SM, Meyer MB. Regulation of gene expression by 1, 25-dihydroxyvitamin D3 in bone cells: exploiting new approaches and defining new mechanisms [J]. Bonekey Rep, 2014, 3:482. doi: 10.1038/bonekey.2013.216. eCollection 2014.

[5] Ooi JH, Chen J, Cantorna MT. Vitamin D regulation of immune func?tion in the gut: why do T cells have vitamin D receptors [J]. Mol As?pects Med, 2012, 33 (1):77-82. doi: 10.1016/j.mam.2011.10.014.

[6] Gandini S, Gnagnarella P, Serrano D, et al. Vitamin D receptor poly?morphisms and cancer [J]. Adv Exp Med Biol, 2014, 810:69-105.

[7] Wong KE, Szeto FL, Zhang W, et al. Involvement of the vitamin D receptor in energy metabolism: regulation of uncoupling proteins[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2009, 296 (4):E820- 828. doi: 10.1152/ajpendo.90763.2008.

[8] Aithal MG, Rajeswari N. Validation of housekeeping genes for gene expression analysis in glioblastoma using quantitative real- time polymerase chain reaction[J]. Brain Tumor Res Treat, 2015, 3(1): 24-29. doi: 10.14791/btrt.2015.3.1.24.

（2015-06-15收稿2015-08-27修回）（

本文編輯魏杰）

藥物臨床觀察

作者單位：蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院綜合實(shí)驗(yàn)室，常州市個(gè)性化診療高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編213003）

Establishing a method for detection of human vitamin D receptor using dual real-time fluorescence quantitative PCR

YU Miaomei，YU Yang，ZHANG Jun，YAO Shuang，PAN Lili，LUO Guanghua△
Comprehensive Laboratory，The Third Affiliated Hospital of Soochow University，Changzhou Key Lab of Individualized
Diagnosis and Treatment Associated with High Technology Research，Changzhou 213003，China
△Corresponding Author E-mail: shineroar@163.com

Abstract:Objective To establish a dual real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (dual realtime PCR) assay to detect human vitamin D receptor (VDR) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Methods GAPDH gene was used as the internal control. The specific primers and TaqMan probes were designed by Primer Premier 5.0 software, which were applied to detect the VDR/GAPDH mRNA levels. The obtained PCR products were puri?fied to construct the VDR/GAPDH recombinant plasmid, which was taken as the standard to analyze the sensitivity and re?peatability of the method. Results The amplification products were confirmed as the specific fragment of VDR/GAPDH by DNA sequencing instrument. The results showed that the sensitivity, linear range, the determinate coefficient, the amplifica?tion efficiency, the intra-assay and inter-assay coefficient of variation were 40 copies/μL, 4.00×101-4.00×105copies/μL, 0.998, 96.10%, 0.09%-1.21%, 0.17%-0.51% for VDR, and 40 copies/μL, 4.00×101-4.00×105copies/μL, 0.999, 85.15%, 0.35%-0.88%, 0.51%-2.46% for GAPDH, respectively. ConclusionThese results demonstrate that the dual real-time PCR assay with high sensitivity and specificity can detect the relative expressions of human VDR by single reaction tube, which can effectively shorten the time and reduce the experimental error.

Key words:receptors, calcitriol; polymerase chain reaction; glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases; vitamin D receptor; dual real-time fluorescence quantitative PCR

中圖分類號(hào)：R331

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.11958/59072

作者簡(jiǎn)介：喻妙梅（1987），女，碩士，主要從事臨床分子診斷方面研究