嵌合抗原受體T細胞治療原發性腫瘤的優勢與研究進展

張巍，閆丹丹，高莉，邵明亮，閆會敏△

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嵌合抗原受體T細胞治療原發性腫瘤的優勢與研究進展

張巍1，閆丹丹2，高莉2，邵明亮1，閆會敏1△

摘要：嵌合抗原受體（Car）T細胞因不僅具有較強特異性識別腫瘤抗原的特性，還具有殺傷性、親和力高等優點，因而受到較多的關注。盡管其在抗腫瘤方面發揮了很多優勢，但是仍存在不足之處，需要進一步優化來提高其臨床應用的安全性。本研究對Car T細胞結構及其生物功能、治療流程、應用進展以及應用風險進行綜述，為進一步在臨床開展Car T免疫治療提供參考。

關鍵詞：嵌合抗原受體T；細胞治療；腫瘤；綜述

△通訊作者E-mail：yanhm_2538@163.com

2013年《Science》雜志評選的“十大科技突破”中，腫瘤免疫治療被列為首位。免疫治療主要包括腫瘤非特異性小分子化合物免疫治療、過繼性細胞免疫治療(adoptive cellular therapy, ACT)、腫瘤疫苗治療、腫瘤單克隆抗體的免疫治療、分子靶向治療和基因治療等。其中ACT應用最為廣泛，是將體外培養的T細胞或自然殺傷（natural killer, NK）細胞回輸到患者體內，目的是利用這些體外培養、活化或者基因修飾的細胞所擁有的抗腫瘤、抗病毒活性來治療疾病[1]。這種治療技術能夠使具有抗腫瘤活性的效應細胞在短時間內擴增、活化，并且僅有輕微的不良反應。目前，腫瘤浸潤淋巴（tumor infiltrating lymphocyte, TIL）細胞、淋巴因子激活殺傷（lymphokine activated killer, LAK）細胞、細胞因子誘導的殺傷（cytokine-induced killer, CIK）細胞、NK細胞和NKT細胞等用于臨床ACT中，取得了一定的療效[2]。一直以來，研究者嘗試使用基因修飾的T淋巴細胞實現對腫瘤細胞的殺傷作用，如使用白細胞介素（IL）-2、IL-15或者T細胞受體（T cell receptor ,TCR）、嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，Car）等來修飾T淋巴細胞[3]。本文對Car T細胞結構、生物功能及其流程和使用范圍綜述如下。

1　Car T細胞結構及其生物功能

Car是一種能夠特異性識別并結合腫瘤抗原的嵌合受體，利用基因工程技術將其與T細胞的活化基序結合，即將抗體對腫瘤抗原的高親和性與T淋巴細胞的殺傷機制相結合，使T細胞表達特異性的Car，從而具有特異性識別并殺傷腫瘤細胞的能力。目前Car結構經歷了3代進化。第1代Car的基本結構，胞內信號域只嵌合TCR/CD3的ζ鏈或免疫球蛋白Fc受體（FcεRI）的γ鏈[4]；第2代Car胞內段添加一個協同刺激分子；第3代Car胞內段添加2個以上協同刺激分子[5]。

Car T細胞因不僅具有較強特異性識別腫瘤抗原的特性，還具有殺傷性、親和力高等優點，因而受到較多關注[6]。Car T細胞能與特異性腫瘤抗原結合，產生主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)非限制性的活化，進而發揮抗腫瘤效應[7]。Car T細胞抗腫瘤作用不依賴人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）分子，而且可使T淋巴細胞尤其是CD8+T細胞繞過抗原提呈細胞，不受免疫逃逸的影響。Car T細胞能夠產生顆粒酶、穿孔素，直接介導腫瘤細胞溶解，也可以誘導巨噬細胞分泌IL-6等，間接影響腫瘤細胞的生長[8]。Car T細胞還能上調表達MHC-Ⅱ、干擾素（interferon，IFN)-γ、CD86、IL-2、IL-15等，對抗腫瘤、抑制微環境，進而影響腫瘤的生長[9]。另外，Car T細胞具有一定的增殖能力，在體外能夠迅速增殖到治療劑量，減少治療等待時間；在體內維持治療劑量，保證治療效果，產生針對特定腫瘤抗原記憶型的T淋巴細胞，增強Car T細胞在臨床試驗中的可行性[5]。Car T細胞與另一種采用TCR基因修飾的T細胞相比，TCR只能識別蛋白類抗原，而Car除可以識別蛋白類抗原外，還可以識別糖類以及糖脂類抗原，因而擴大了靶點的選擇范圍[10]。與抗體藥物相比，Car T細胞成功地將抗體的靶向特異性與T細胞結合起來用于腫瘤治療，不僅具有靶向特異性，還具有歸巢和組織穿透的能力[11]。

2　Car T細胞治療試驗流程

Car T技術應用于臨床包括特異性抗腫瘤細胞的制備及回輸，具體流程分為以下步驟：（1）在細胞治療前，需進行全面實驗室及影像學的常規檢查。從癌癥患者外周血單個核細胞中分離出細胞。（2）在1～2周的時間內完成細胞的體外激活、擴增和質量檢測。利用基因工程將CD3-ζ鏈或FcεR Ⅰγ的胞內部分在體外偶聯為一個嵌合蛋白，通過基因轉導的方法轉染患者的T細胞，使其表達Car。患者的T細胞被“重編碼”后，生成大量腫瘤特異性的Car T細胞。（3）體外培養，大量擴增細胞至治療所需劑量，一般需要單位體積1× 108～1×109/L以上。（4）進行回輸之前清除患者體內的免疫抑制細胞，減少腫瘤負荷，從而起到增強療效的作用。（5）回輸細胞，觀察療效并嚴密監測不良反應，包括可能的發熱、B細胞抑制、細胞因子效應等。（6）對接受細胞治療的患者進行長期隨訪，關注患者原發疾病的狀態、患者免疫系統功能及各系統功能的情況。定期進行CT掃描、骨髓免疫組化淋巴細胞持續增殖觀察，外周血淋巴細胞表面標志的流式細胞檢查等。

3　Car T治療腫瘤的應用進展

3.1血液腫瘤Car T細胞回輸后會在患者體內大量擴增，并清除白血病細胞,也是目前細胞治療應用效果較好的領域。為了更好地活化T細胞，很多試驗開始研究第3代Car，如CD23、免疫球蛋白κ鏈等，尋找最佳的信號組合。有學者認為，腫瘤壞死因子CD134-4-1BB協同刺激可使Car T細胞持續穩定增殖[12]。有研究顯示5例復發難治的成人急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）患者接受抗CD19 Car修飾的T細胞治療后獲得了完全緩解[13]。有研究表明抗CD38、CD56的Car T對人多發性骨髓瘤（Multi?ple myeloma，MM）細胞有較強的細胞毒性[14]。

在美國血液學會（ASH）第55屆年會上，3個課題組分別報道了抗CD19的Car T細胞在治療慢性、急性淋巴細胞性白血病以及B細胞淋巴瘤的早期臨床治療效果。研究者構建了不同結構的Car T細胞，如FAP特異性Car T細胞、抗PSMA-Car T細胞、FR-Car-T細胞、EGFRv-ICOS-Car-T細胞、GD2-Car-T細胞[15]。賓夕法尼亞大學Michael Kalos對6例慢性淋巴細胞白血病患者、4例ALL兒童以及2例ALL成人患者行靶向CD19的Car T細胞治療，除1例淋巴細胞白血病兒童外，其余患者外周血或骨髓中均未發現B細胞，獲得完全緩解。費城大學Stephan Grupp對60多例復發急淋和慢淋患者行靶向CD19的Car T細胞治療，其緩解率達90%。James N. Kochenderfer對13位難治性B細胞淋巴瘤患者行靶向CD19的Car T細胞治療，12例獲得部分或完全緩解[15]。

3.2原發性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC) HCC是一種常見的惡性腫瘤，肝癌患者體內天然免疫、特異性免疫功能低下，根治性手術切除率低，術后復發率高，放射、化學治療療效差，易發生肝內播散及肝外轉移，因此急需尋找新的有效治療方法。

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的感染增加患者發生肝硬化和肝癌的風險。HBV的共價閉環DNA（covalen?tiy closed circular DNA, cccDNA）是病毒復制的模板，構建cccDNA特異性Car T細胞，并回輸至感染HBV小鼠模型中，結果顯示cccDNA特異性Car T細胞在HBV感染的小鼠中可存活和擴增，并定位于病毒感染的肝臟部位，特異性識別并殺傷有HBV復制的肝癌細胞，發揮抗腫瘤效應[16]。另有研究成功構建兩種靶向黏蛋白（mucin，MUC1）Car表達框的重組慢病毒Jurkat Car T細胞株，兩種Jurkat Car T細胞均能特異性識別MUC1分子，特異性殺傷MUC1高表達的肝癌細胞QGY-7701，但是對MUC1低表達的正常肝細胞基本不殺傷[17]。

3.3其他腫瘤研究顯示Car T細胞在治療肺癌、前列腺癌、卵巢癌、神經膠質瘤、神經母細胞瘤等其他腫瘤中發揮強烈的抗腫瘤效應。有研究應用針對神經節苷脂（GD2）的Car T細胞治療11例兒童神經母細胞瘤患者，在8例可評價療效患者中4例患者出現腫瘤壞死與消退，其中1例患者為完全緩解，這11例患者隨訪2年均未見明顯不良反應[18]。有研究對19例接受抗GD2 Car T細胞治療的高危神經母細胞瘤患者進行長期隨訪，發現GD2-CAR-T細胞具有抗神經母細胞瘤作用，這些Car T細胞可在患者體內擴增并持續存在，而Car T細胞的持續存在與患者的長期生存相關[19]。另有研究應用間皮素特異性mRNA Car T細胞治療間皮素高表達的晚期實體瘤，取得了較好的臨床療效[20]。

4　Car T細胞治療腫瘤的應用風險

Car T細胞治療腫瘤的應用風險包括：（1）Car T細胞用于臨床治療的首要問題就是脫靶效應。Car T細胞定向的腫瘤抗原大多數為腫瘤相關抗原，這樣就會導致對其他組織的免疫攻擊，若這些抗原在重要的臟器上有表達，就會造成免疫系統的損傷。在臨床試驗前，可應用抗體封閉正常組織上的腫瘤相關性抗原(tumor associated antigen，TAA)，降低每次輸注的Car T細胞數量，構建跨信號Car（Car結構中T細胞活化信號1即CD3ζ與共刺激信號CD28分子不直接相連）或者通過引入自殺基因系統來預防及治療這種脫靶毒性。（2）Car T細胞大量殺傷腫瘤細胞，產生細胞因子（如IFN-γ、IFN-α、TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12等）的大量釋放進入血液循環，形成細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS），引起患者急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory dis?tress synodrome, ARDS）和多器官衰竭（multiple organ dysfunc?tion synodrome, MODS）。例如結腸癌伴肝肺轉移患者在接受特異性Car T細胞回輸聯合環磷酰胺非清髓預處理，迅速出現ARDS導致死亡[21]。（3）插入T細胞中的外源DNA片段造成了T細胞結構的改變，從而有一定的致瘤風險。（4）轉染方式的選擇也限制了其臨床應用。電穿孔轉染效率低、失敗率高，造成時間的浪費。目前，最具有臨床應用前景的慢病毒法雖然轉染效率高，但是仍有基因毒性。（5）免疫逃逸也是Car T細胞免疫治療中遇到的問題。若腫瘤細胞下調表面抗原的表達，會影響Car T細胞的治療效果，并且腫瘤細胞異質性較高，即使是同種類型的腫瘤抗原也有可能表達不同細胞表面抗原，進而使臨床治療效果不佳[22]。

美國重組DNA咨詢委員會在2010年針對Car T細胞在臨床試驗中出現的問題提出了以下幾點建議[23]：（1）引入自殺基因的人工調控開關，誘導轉染自殺基因并識別靶抗原的T細胞凋亡來減輕相關的毒性反應。（2）臨床上嚴格按照Ⅰ期臨床試驗進行治療，采用劑量爬坡的適量方法，把細胞劑量由小到大分幾次回輸到患者體內，防止速發的細胞毒性。（3）在T細胞中同時轉入抑制性的Car，構建雙靶抗原Car T細胞。抑制性的Car將與效應T細胞的激活產生拮抗作用。（4）臨床上在使用第2代或者第3代Car T細胞治療時，不用或者謹慎使用IL-2，進而降低潛在的細胞毒性。（5）采用低劑量、多次輸注Car T細胞的方法，建立免疫記憶的潛能、增加Car T細胞的抗腫瘤特異性，減少對健康組織的損傷。

5　小結

隨著細胞免疫治療HCC技術的不斷進步，Car T細胞免疫治療越來越受到人們的關注。盡管其在抗腫瘤方面發揮了很多優勢，但是仍存在不足之處，需要進一步優化來提高其臨床應用的安全性。如何在提高Car T細胞特異性殺傷腫瘤細胞的同時避免各種風險是目前迫切需要解決的問題。但是，筆者認為，隨著醫學研究的不斷深入，Car T細胞免疫治療應用于原發性腫瘤將會成為細胞免疫治療的中堅力量。

參考文獻

[1] Enblad G, Karlsson H, Loskog AS. Car T-cell therapy: the role of physical barriers and immunosuppression in lymphoma[J]. Hum Gene Ther, 2015, 26(8):498-505. doi: 10.1089/hum.2015.054.

[2] Chen F, Fan C, Gu X, et al. Construction of anti-CD20 singlechain antibody-CD28-CD137-TCRζ recombinant genetic modified T cells and its treatment effect on B cell lymphoma[J]. Med Sci Monit, 2015,21(21):2110-2115. doi: 10.12659/MSM.893791.

[3] Huang X, Park H, Greene J, et al. IGF1R- and ROR1-specific Car T cells as a potential therapy for high risk sarcomas[J]. PLoS One, 2015, 10(7):e0133152. doi: 10.1371/journal.pone.0133152.

[4] Maude SL, Teachey DT, Porter DL, et al. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia [J]. Blood, 2015, 125(26): 4017-4023. doi: 10.1182/blood-2014-12-580068.

[5] Kalos M, Levine BL, Porter DL, et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia[J]. Sci Transl Med, 2011, 3(95): 95ra73. doi: 10.1126/scitranslmed.3002842.

[6] Ramos CA, Dotti G. Chimeric antigen receptor (CAR)-engineered lymphocytes for cancer therapy[J]. Expert Opin Biol Ther, 2011, 11 (7):855-873. doi: 10.1517/14712598.2011.573476.

[7] Zhou ZF, Jiang JH, Li JY, et al. IL-12 induced antitumor effects of NK cells in the microenvironment of hepatocellular carcinoma[J]. Chinese Journal of Cancer Biotherapy, 2013,20（1）：93-98. [周智鋒，江金華，李潔羽，等，IL-12誘導肝癌微環境中NK細胞活化發揮抗腫瘤作用[J].中國腫瘤生物治療雜志，2013,20（1）：93-98]. doi：10.3872/j.issn.1007-385X.2013.01.016.

[8] Spear P, Barber A, Rynda-Apple A, et al. Chimeric antigen recep?tor t cells shape myeloid cell function within the tumor microenvi?ronment through IFN-α and GM-CSF[J]. J Immunol, 2012, 188(12): 6389-6398.doi: 10.4049/jimmunol.1103019.

[9] Grupp SA, Kalos M, Barrett D, et al. Chimeric antigen receptormodified T cells for acute lymphoid leukemia[J]. N Engl J Med, 2013, 368(16):1509-1518. doi: 10.1056/NEJMoa1215134.

[10] Han EQ, Li XL, Wang CR, et al. Chimeric antigen receptor-engi?neered T cells for cancer immunotherapy: progress and challenges [J]. J Hematol Oncol, 2013, 6:47. doi: 10.1186/1756-8722-6-47.

[11] Jones BS, Lamb LS, Goldman F, et al. Improving the safety of cell therapy products by suicide gene transfer[J]. Front Pharmacol, 2014, 5:254. doi: 10.3389/fphar.2014.00254.

[12] Meylan F, Hawley ET, Barron L, et al. The TNF-family cytokine TL1A promotes allergic immunopathology through group 2 innate lymphoid cells[J]. Mucosal Immunol, 2014, 7(4):958- 968. doi: 10.1038/mi.2013.114.

[13] Ma Q, Wang Y, Lo AS, et al. Cell density plays a critical role in ex vivo expansion of T cells for adoptive immunotherapy[J]. J Biomed Biotechnol, 2010, 2010:386545. doi: 10.1155/2010/386545.

[14] Pak Y, Zhang Y, Pastan I, et al. Antigen shedding may improve effi?ciencies for delivery of antibody-based anticancer agents in solid tumors[J]. Cancer Res, 2012, 72(13):3143- 3152. doi: 10.1158/ 0008-5472.CAN-11-3925.

[15] Krebs K, B?ttinger N, Huang LR, et al. T cells expressing a chime?ric antigen receptor that binds hepatitis B virus enxelope proteins control virus replicatong in mice.[J]. Gastroenterology, 2013, 145(2): 456-465.doi: 10.1053/j.gastro.2013.04.047.

[16] Brentjens RJ, Curran KJ, Seinstra BA, et al. Enhancing antitumor ef?ficacy of chimeric antigen receptor T cells through constitutive CD40L expression[J]. Mol Ther, 2015, 23(4):769-778. doi: 10.1038/ mt.2015.4.

[17] Song DG, Ye Q, Carpenito C, et al. In vivo persistence,tumor local?ization,and antitumoractivity of CAR- engineered T cells is en?hanced bycostimulatory signaling through CD137 (4-1BB)[J]. Can?cer Res, 2011, 71(13):4617-4627. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-11-0422.

[18] Shen CJ, Yang YX, Han EQ, et al. Chimeric antigen receptor con?taining ICOS signaling domain mediates specific and efficient anti?tumor effect of T cells against EGFRvIII expressing glioma[J]. J He?matol Oncol, 2013, 6:33. doi: 10.1186/1756-8722-6-33.

[19] Ma YD, Wang Z, Gong RZ, et al. Target to mucin 1 chimeric anti?gen receptor modified Jurkat T cell specific killer hepatoma cells[J]. Journal of Second Military Medical University, 2014,11 (35):1177-1182. [馬宜冬，王真，鞏睿智，等，靶向黏蛋白1嵌合抗原受體修飾的Jurkat T細胞特異殺傷肝癌細胞[J].第二軍醫大學學報，2014,11（35）:1177-1182]. doi:10.3724/SP.J.1008.2014.01177.

[20] Louis CU, Savoldo B, Dotti G, et al. Antitumor activity and longterm fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma[J]. Blood, 2011, 118(23):6050-6056. doi: 10.1182/ blood-2011-05-35444.

[21] Hillerdal V, Essand M. Chimeric antigen receptor- engineered T cells for the treatment of metastatic prostate cancer[J]. Bio Drugs, 2015, 29(2):75-89. doi: 10.1007/s40259-015-0122-9.

[22] Lamers CH, van Steenbergen-Langeveld S, van Brakel M, et al. Tcell receptor-engineered T cells to treat solid tumors: T cell pro? cessing toward optimal T cell fitness[J]. Hum Gene Ther Methods, 2014, 25(6):345-357. doi: 10.1089/hgtb.2014.051.

[23] Beatty GL, Haas AR, Maus MV, et al. Mesothelin-specific chimeric antigen receptor mRNA-engineered T cells induce anti-tumor ac?tivity in solid malignancies[J]. Cancer Immunol Res, 2014, 2(2): 112-120. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-13-0170.

（2015-05-14收稿2015-09-23修回）

（本文編輯陳麗潔）

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作者單位：1石家莊市第五醫院研究所（郵編050021）；2河北師范大學

The advantages and research progress of T cells of the chimeric antigen receptor in the treatment of primary tumors

ZHANG Wei1, YAN Dandan2, GAO Li2, SHAO Mingliang1, YAN Huimin1△
1 Institute of Liver Diseases, Shijiazhuang Fifth Hospital, Shijiazhuang 050021, China; 2 Hebei Normal University
△Corresponding Author E-mail: yanhm_2538@163.com

Abstract:Chimeric antigen receptor (Car) T cells, not only have the characteristics of strong specific recognition of tu?mor antigens, but also have destruction and high affinity advantages, thus receiving more attention. Although it has played a lot of advantages in anti-tumor, it still has some shortcomings, which needs to be further optimized to improve the safety of its clinical application. In this study, The cell structure and biological function, treatment process, application development and application risk of Car T cells are reviewed, which provide references for further clinical immunotherapy of Car T.

Key words:Car T; cell therapy; neoplasms; review

中圖分類號：R73-36+2

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/58917

基金項目：河北省衛生廳科研項目（ZD20140735）

作者簡介：張巍（1976），女，副主任醫師，主要從事腫瘤早期干預研究