黃連溫膽湯對2型糖尿病大鼠肝損傷的保護作用

劉　舟，李月碧，張衛華，劉華東，馬世平

(1. 南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023；2. 中國藥科大學，江蘇 南京 211198)

?

黃連溫膽湯對2型糖尿病大鼠肝損傷的保護作用

劉舟1，李月碧2，張衛華1，劉華東1，馬世平2

(1. 南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023；2. 中國藥科大學，江蘇 南京 211198)

[摘要]目的觀察黃連溫膽湯對2型糖尿病大鼠肝損傷的保護作用。方法取10只健康雄性SD大鼠作為空白組，給予常規飼料喂養；另取健康雄性SD大鼠60只采用50 d高糖高脂飼料喂養合并一次性鏈脲佐霉素(STZ)35 mg/kg腹腔注射方法構建2型糖尿病大鼠模型。將50只造模成功大鼠隨機分為模型組,二甲雙胍組及黃連溫膽湯低、中、高劑量組，每組10只。二甲雙胍組給予二甲雙胍0.2 g/kg灌胃，黃連溫膽湯低、中、高劑量組分別給予黃連溫膽湯3，6，12 g/kg灌胃，模型組和空白組灌胃等體積生理鹽水，均連續灌胃30 d。末次灌胃后測定大鼠飲食量、飲水量、尿量，取血檢測血清谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)，之后處死大鼠鏡下觀察肝臟組織表現，計算肝質量指數。結果模型組大鼠的食量、飲水量和尿量均明顯高于空白組(P均<0.05)；各給藥組大鼠的飲水量和尿量均明顯低于模型組(P均<0.05)，各給藥組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；各給藥組大鼠的飲食量與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。模型組大鼠肝質量指數及血清AST、ALT水平均明顯高于空白組(P均<0.05)；各給藥組大鼠肝質量指數及血清AST、ALT水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。鏡下觀察各給藥組大鼠肝臟組織中細胞空泡和炎癥細胞浸潤均明顯減少。結論黃連溫膽湯能抑制糖尿病大鼠的肝腫大和炎癥反應，降低血清AST和ALT水平及肝質量指數，保護肝細胞。

[關鍵詞]糖尿病； 肝損傷； 黃連溫膽湯

隨著人們生活水平的提升，糖尿病的發病率越來越高。糖尿病以代謝紊亂和高血糖為主要特征，可引起全身多臟器的病變。肝臟是糖代謝的主要器官，長期的高血糖對肝臟的損害十分嚴重，但因其代償能力較強，早期的肝損傷并不明顯，但到后期肝損傷發展到一定程度后將無法逆轉。文獻報道糖尿病肝病的發生率為10%～30%[1]，且糖尿病患者死亡多因肝細胞損傷所引起[2]。肝臟是糖脂代謝的關鍵部位，糖尿病中出現的高血糖和脂質堆積超出了肝臟的清除能力，造成肝臟損害，而肝臟損害之后糖脂代謝的調節能力進一步下降，最終形成惡性循環，使得病變更加嚴重[3]。目前治療糖尿病的口服化學性降糖藥都有一定的不良反應，且對肝臟有損傷作用，因此使得糖尿病肝損傷的治療難度加大。中醫認為熱毒、瘀毒、痰毒、濕毒是糖尿病肝損傷的病因，因此可以通過清熱、活血、祛痰、化濕、解毒等方法治療糖尿病肝損傷[4]。黃連溫膽湯是中醫名方，首見于清朝陸廷珍的《六因條辨》，其主要功效是清熱燥濕、理氣化痰。臨床研究發現黃連溫膽湯對糖尿病[5]及其并發癥[6]、代謝綜合征[7]有很好的治療作用，但對糖尿病引起的肝損傷的影響尚少見報道，故本研究通過大鼠實驗觀察了黃連溫膽湯對2型糖尿病引起的肝損傷的保護作用，現將結果報道如下。

1實驗資料

1.1藥材與試劑黃連、竹茹、半夏、陳皮、枳實、茯苓、甘草、生姜均購自先聲再康藥店。谷草轉氨酶(AST，批號：20131102)、谷丙轉氨酶(ALT，批號：20141102)測試試劑盒購自南京建成生物有限公司。鏈脲佐霉素(STZ)購自Sigma公司，用檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.4)配制成10 mg/mL的溶液，避光保存，現配現用。磷酸鹽緩沖液(PBS)由8.0 g NaCl+0.20 g KCl+1.44 g Na2HPO4+0.24 g KH2PO4溶于800 mL雙蒸水中，用HCl調節pH至7.4，加水至1 L。

1.2儀器酶標儀(Thermo，美國)，低溫離心機(Kubota，日本)，HH-4數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)，電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)等。

1.3動物清潔級雄性SD大鼠70只，購自江蘇大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(蘇)2009-0002，體質量180～200 g。動物分籠飼養，12 h晝夜節律，室溫22～24 ℃，自由飲食飲水。

1.4方法

1.4.1藥材處理黃連溫膽湯中各藥物的比例按照清代陸皮∶茯苓∶甘草∶生姜=4∶4∶4∶4∶6∶3∶2∶2)。將飲片浸泡30 min，水煎煮2次，每次煎30 min，用紗布趁熱濾過，60 ℃恒溫水浴濃縮至1.2 g/mL，冷藏備用。

1.4.2動物分組與2型糖尿病模型的建立取10只健康雄性SD大鼠作為空白組，給予常規飼料喂養；其余60只大鼠均用高糖高脂飼料(10%豬油、15%蔗糖、5%蛋黃粉、0.5%膽固醇、0.5%膽酸鹽、69%常規飼料)喂養50 d后，一次性腹腔注射STZ 35 mg/kg。1周后測定大鼠血糖，血糖值>13.9 mmol/L證實造模成功。將50只造模成功大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組及黃連溫膽湯低、中、高劑量組，每組10只。二甲雙胍組給予二甲雙胍0.2 g/kg 灌胃，黃連溫膽湯低、中、高劑量組分別給予黃連溫膽湯3，6，12 g/kg(生藥材量)灌胃，模型組和空白組灌胃等體積生理鹽水。每日9：00—11：00灌胃給藥，連續給藥30 d。

1.4.3食量、飲水量和尿量的測定末次灌胃后，將大鼠分別放入代謝籠中測定大鼠24 h內食量、飲水量和尿量。

1.4.4血清谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)水平的測定各組大鼠眼眶取血2 mL，靜置后3 500 r/min 4 ℃離心10 min，吸取上層血清，按照試劑盒說明書測定血清AST、ALT水平。

1.4.5肝臟組織病理觀察每組取3只大鼠麻醉后，固定在實驗臺上，剪開胸腔，從心尖插入針，剪開右心耳，向心室內灌注150 mL PBS和100 mL 4%多聚甲醛后取出肝臟，放入10%福爾馬林溶液中固定。使用冰凍切片機將肝臟切成4 μm的切片，用石蠟包埋好。根據說明書脫水、透明再進行肝臟HE染色，封片后在光學顯微鏡400倍視野下觀察組織病變情況。

1.4.6肝質量指數每組剩余大鼠處死后完整取出大鼠肝臟稱質量，計算肝質量指數=肝質量/體質量×100%。

2結果

2.1各組大鼠基礎代謝情況比較模型組大鼠的食量、飲水量和尿量均明顯高于空白組(P均<0.05)；各給藥組大鼠的飲水量和尿量均明顯低于模型組(P均<0.05)，各給藥組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；各給藥組大鼠的飲食量與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠食量、飲水量和尿量比較±s)

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.2各組肝質量指數和血清AST、ALT水平比較模型組大鼠肝質量指數及血清AST、ALT水平均明顯高于空白組(P均<0.05)。各給藥組大鼠肝質量指數及血清AST、ALT水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，各給藥組間血清AST水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；黃連溫膽湯高劑量組ALT水平明顯低于黃連溫膽湯低劑量組(P<0.05)，而與二甲雙胍組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2　各組肝質量指數和血清AST、ALT水平比較±s)

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與黃連溫膽湯低劑量組比較，P<0.05。

2.3各組大鼠肝臟病理表現光學顯微鏡下發現空白組肝細胞排列整齊，核圓、大，居中，無炎癥細胞浸潤；模型組與空白組相比出現了明顯的細胞皺縮，細胞核被擠到一邊，細胞間空泡增多增大，炎癥細胞浸潤增多；而各給藥組細胞空泡和炎癥細胞浸潤均明顯減少。見圖1～6。

圖1　空白組肝臟組織鏡下表現(HE，400×)

圖2　模型組肝臟組織鏡下表現(HE，400×)

圖3　二甲雙胍組肝臟組織鏡下表現(HE，400×)

圖4　黃連溫膽湯低劑量組肝臟組織鏡下表現(HE，400×)

圖5　黃連溫膽湯中劑量組肝臟組織鏡下表現(HE，400×)

圖6　黃連溫膽湯高劑量組肝臟組織鏡下表現(HE，400×)

3討論

糖尿病是繼心血管疾病和腫瘤后的第三大威脅人類健康的非傳染性疾病[8]，其中90%為2型糖尿病。2型糖尿病的主要特征是胰島素抵抗造成的糖脂紊亂，而肝臟作為糖脂代謝的關鍵器官，受到的損傷最為嚴重，臨床主要表現為肝腫大、脂肪肝、肝纖維化、肝硬化等。肝臟是糖原儲存的主要器官，機體各部分的能量供應都是依賴于肝糖原分解成葡萄糖通過血液輸送至各組織細胞的。胰島素的分泌不足使得肝臟中的糖原難以被分解利用，因此長期的高血糖狀態引起肝臟內糖原過多蓄積，使得肝細胞腫脹，代謝紊亂,最終引起肝臟組織損傷[9]。另一方面，糖尿病患者對糖的利用障礙導致脂肪組織大量動員，外周組織中脂肪分解增多，引起血液中游離脂肪酸增高，通過門靜脈系統進入肝臟，引起肝細胞中過度的脂質堆積，也會損傷肝臟[10]。AST和ALT是臨床肝功能檢查的指標，主要位于肝細胞內，肝臟損傷后會引起細胞內ALT和AST滲漏進入血液，結果使血清中 ALT 及 AST 含量升高。此外，肝細胞的破壞能引起炎性反應，會使得組織外液內流導致肝臟腫大。

黃連溫膽湯由二陳湯衍化而來，方中黃連清熱燥濕，竹茹清熱化痰，半夏、陳皮配伍燥濕化痰，茯苓健脾滲濕，枳實行氣破滯，生姜和胃，甘草調和諸藥，諸藥合用共奏清熱化痰行氣之功。本研究通過長期高脂飼料喂養合并小劑量STZ腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，結果顯示，模型組大鼠的食量、飲水量和尿量均明顯高于空白組；各給藥組大鼠的飲水量和尿量均明顯低于模型組，各給藥組間比較差異無統計學意義；各給藥組大鼠的飲食量與模型組比較差異無統計學意義，推測可能受到了其他因素的調控。模型組大鼠肝質量指數及血清AST、ALT水平均明顯高于空白組；各給藥組大鼠肝質量指數及血清AST、ALT水平均明顯低于模型組。鏡下觀察各給藥組大鼠肝臟組織中細胞空泡和炎癥細胞浸潤均明顯減少。表明黃連溫膽湯對2型糖尿病大鼠引起的肝損傷有較好的逆轉作用。

綜上所述，黃連溫膽湯能抑制糖尿病大鼠的肝腫大和炎癥反應，降低血清AST和ALT水平及肝質量指數，保護肝細胞。但其作用機制還需要進一步研究。

[參考文獻]

[1]沈稚舟,吳松華,邵福源. 糖尿病慢性并發癥[M]. 上海：上海醫科大學出版社,1999:321

[2]Grundy SM,Cleeman JI,Daniels SR,et al. Diagnosis and management of the metabolic syndrome:an Ameriean Heart Association/National Heart,Lung,and Blood Institute scientific statement:Executive Summary[J]. Crit Pathw Cardiol,2005,4(4):198-203

[3]Day CP,James OF. Steatohepatitis:A tale of two “hits”?[J]. Gastroenterology,1998,114(4):842-845

[4]張曉靜，宋魯成. 糖尿病肝損害的中西醫認識[J]. 內蒙古中醫藥,2009，28(2):95-96

[5]余曉琳,陳軍平. 黃連溫膽湯治療濕熱困脾型初發2型糖尿病78例臨床觀察[J]. 新中醫,2010,42(4):25-26

[6]楊亞民,李雪瑞,田軍. 黃連溫膽湯為主治療糖尿病腎病60例[J]. 內蒙古中醫藥,2001,20(4):12

[7]劉莉,鄧曉威,金娟. 黃連溫膽湯對代謝綜合征大鼠核轉錄因子及腫瘤壞死因子的影響[J]. 中醫藥信息,2012,29(4):67-70

[8]Chan JC,Malik V,Jia W,et al. Diabetes in Asia:epidemiology,risk factors,and pathophysiology[J]. JAMA,2009,301(20):2129-2140

[9]冼蘇,王乃尊,韋敏怡,等. 糖尿病性肝腫大臨床及病理研究[J]. 廣西醫科大學學報,1996,13(3):7-11

[10] Dowman JK,Tomlinson JW,Newsome PN. Pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease[J]. QJM,2010,103(2):71-83

Protective effect of Huanglian Wendan decoction on liver damage in rat model of type 2 diabetic mellitus

LIU Zhou1, LI Yuebi2, ZHANG Weihua1, LIU Huadong1, MA Shiping2

(1. Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China; 2. China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, Jiangsu, China)

Abstract:Objective It is to observe the protective effect of Huanglian Wendan decoction on liver damage in rat model of type 2 diabetic mellitus. Methods 10 healthy male SD rats were selected as blank group and were fed with normal fodder, another 60 rats were given 50 days high-glucose-high-fat diet and 35 mg/kg streptozocin (STZ) injection once to establish rat models of type 2 diabetic mellitus. 50 successful rat models were divided into model group treated with normal saline, metformin group treated with metformin (0.2 g/kg), and low, middle and high dose of Huanglian Wendan decoction groups treated with Huanglianwendan decoction (3, 6, 12 g/kg respectively), all the rats were treated by gavage for 30 days. After the end of gabage, the consumption of food, water and urinary volume were recorded and serum AST and ALT were determined, then the rats were killed to observe liver tissue changes under light microscope and calculate liver weight index. Results The consumption of food, water and urinary volume of the rats in model group were more than that in blank group (P all<0.05); the quality of water drink and urinary volume in every treatment group were less than that in model group (P all<0.05), there was no significant difference among every treatment group (P all>0.05). The difference in quality of food consumption was not significant between model group and other treatment groups (P all>0.05). Liver index and serum levels of AST and ALT in model group were higher than that in blank group (P all<0.05), but these indicators in every treatment group were lower than that in model group (P all<0.05). Light microscope showed than cell vacuolation and inflammatory cell invasion decreased obviously in every treatment group. Conclusion Huanglian Wendan decoction can inhibit hepatomegaly and inflammatory reaction in the rats with type 2 diabetic mellitus, decrease the levels of serum AST and ALT and liver weight index, protect liver cells.

Key words:diabetes; liver damage; Huanglian Wendan decoction

[收稿日期]2015-09-15

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)02-0119-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.02.002

[基金項目]教育部博士點基金項目(20113237120007)；江蘇省高校自然科學研究計劃項目(12KJD360002)；江蘇省中醫藥局科技項目(LZ13001)；南京中醫藥大學國家基金預研項目(12XYY03)

[作者簡介]劉舟，女，博士，講師，從事中醫藏象與病因病機的研究。[通信作者]張衛華，E-mail：zwhtcm@163.com