丹參注射液對(duì)氧誘導(dǎo)幼鼠視網(wǎng)膜增生變性的保護(hù)作用

曹美玲，吳紅敏

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 沈陽 110001)

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丹參注射液對(duì)氧誘導(dǎo)幼鼠視網(wǎng)膜增生變性的保護(hù)作用

曹美玲，吳紅敏

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 沈陽 110001)

[摘要]目的探討丹參注射液對(duì)氧誘導(dǎo)幼鼠視網(wǎng)膜凋亡相關(guān)基因的表達(dá)及其外周血血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的影響，以明確其抑制視網(wǎng)膜增生變性的作用機(jī)制。方法將100只出生7 d的SD幼鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及丹參注射液4，2，1 g/kg組，每組20只。對(duì)照組幼鼠生活在正常氧環(huán)境下，其余4組幼鼠均制成視網(wǎng)膜病變模型。模型組給予腹腔注射生理鹽水，丹參注射液4，2，1 g/kg組分別給予腹腔注射相應(yīng)劑量的丹參注射液，連續(xù)注射5 d后處死幼鼠，經(jīng)右側(cè)眼球取靜脈血檢測(cè)VEGF濃度，取出眼球用RT-PCR法檢測(cè)視網(wǎng)膜中bax與bcl-2 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果模型組幼鼠視網(wǎng)膜組織中bax mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，而血清VEGF濃度與視網(wǎng)膜組織中bcl-2 mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。丹參注射液2 g/kg組血清VEGF濃度及視網(wǎng)膜組織中bcl-2 mRNA表達(dá)水平均明顯低于丹參注射液1 g/kg組(P均<0.05)，高于丹參注射液4 g/kg 組(P均<0.05)；視網(wǎng)膜組織中bax mRNA表達(dá)水平明顯高于丹參注射液1 g/kg組(P<0.05)，低于丹參注射液4 g/kg組(P<0.05)。bax mRNA表達(dá)水平與bcl-2 mRNA表達(dá)水平間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.653，P<0.05)。結(jié)論丹參注射液能抑制氧誘導(dǎo)的幼鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞增生。

[關(guān)鍵詞]早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變；丹參注射液；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；凋亡

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)，盡管近年來在診斷和治療上有明顯進(jìn)步，但是視網(wǎng)膜病變?nèi)允侵饕旅ぴ蛑籟1]。為有效治療視網(wǎng)膜病變，降低其發(fā)病率，揭示該病的發(fā)生機(jī)制成為目前迫切需要解決的問題。丹參注射液具有捕獲游離基、改善微循環(huán)、抑制細(xì)胞凋亡等功效，是一種抗氧化劑[2]，但是其對(duì)氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜增生抑制作用尚不明確。故本研究以SD幼鼠進(jìn)行氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型的建立，探討丹參注射液對(duì)氧誘導(dǎo)幼鼠視網(wǎng)膜凋亡相關(guān)基因的表達(dá)及其外周血血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的影響，以明確其抑制視網(wǎng)膜增生變性的作用機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物100只出生7 d SD幼鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：0034309。

1.2主要試劑丹參注射液為廣東永康藥業(yè)有限公司提供，規(guī)格：0.1 g/mL，批號(hào)：140231B；外周血清VEGF 濃度ELISA檢測(cè)試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品；RT-PCR試劑盒為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；Trizol試劑為美國(guó)Introgen公司產(chǎn)品。

1.3主要儀器ASD-310S型低溫離心機(jī)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；PCR儀為德國(guó)Biometra公司產(chǎn)品。

1.4方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理將100只出生7 d的SD幼鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及丹參注射液4，2，1 g/kg 組，每組20只。所有幼鼠均由母鼠喂養(yǎng)，人工控溫21～25 ℃，12 h光照，12 h黑暗。對(duì)照組幼鼠生活在正常氧環(huán)境下，其余4組幼鼠均參照文獻(xiàn)[3]方法制成視網(wǎng)膜病變模型：幼鼠于生后與同籠的2只母鼠一起裝入有機(jī)玻璃制作的密閉氧箱(一端設(shè)計(jì)為進(jìn)氣孔，另一端設(shè)計(jì)為出氣孔)飼養(yǎng)，先將玻璃容器內(nèi)氣體抽出成為真空狀態(tài)，然后接入濕潤(rùn)醫(yī)用純氧氣(1.5 L/min)，氧分壓保持在75%，每2 d打開玻璃容器更換墊料加食、換水并替換母鼠。在高氧環(huán)境中飼養(yǎng)5 d(至出生12 d)后返回正常空氣中飼養(yǎng)5 d(至出生17 d)，模型組出籠后給予腹腔注射生理鹽水，丹參注射液4，2，1 g/kg組分別給予腹腔注射相應(yīng)劑量的丹參注射液，均連續(xù)腹腔注射5 d(至出生17 d)。

1.4.3VEGF濃度測(cè)定經(jīng)右側(cè)眼球取靜脈血用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定VEGF濃度，所取標(biāo)本均在1 周內(nèi)測(cè)定。

2結(jié)果

2.1視網(wǎng)膜組織中bax、bcl-2 mRNA表達(dá)水平模型組幼鼠視網(wǎng)膜組織中bax mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。丹參注射液2 g/kg 組視網(wǎng)膜組織中bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯低于丹參注射液1 g/kg 組(P<0.05)，但高于丹參注射液4 g/kg 組(P<0.05)；視網(wǎng)膜組織中bax mRNA表達(dá)水平明顯高于丹參注射液1 g/kg 組(P<0.05)，但低于丹參注射液4 g/kg 組(P<0.05)。bax mRNA表達(dá)水平與bcl-2 mRNA表達(dá)水平間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.653，P<0.05)。見表1。

表1　各組視網(wǎng)膜組織中bax、bcl-2 mRNA

注：①與對(duì)照組比較,P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與丹參注射液4 g/kg 組比較，P<0.05；④與丹參注射液2 g/kg 組比較，P<0.05。

2.2VEGF濃度檢測(cè)結(jié)果對(duì)照組VEGF濃度為(44.67±5.78)nmol/mL，模型組為(66.78±8.31)nmol/mL，丹參注射液4 g/kg組為(53.53±5.43)nmol/mL ，丹參注射液2 g/kg組為(57.34±6.43)nmol/mL，丹參注射液1 g/kg組為(61.45±7.65)nmol/mL。模型組血清VEGF濃度明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；丹參注射液各組血清VEGF濃度均明顯低于模型組(P均<0.05)；丹參注射液4 g/kg組和丹參注射液2 g/kg組血清VEGF濃度均明顯低于丹參注射液1 g/kg組(P<0.05)，且丹參注射液4 g/kg組明顯低于丹參注射液2 g/kg組(P<0.05)。

3討論

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變是指發(fā)生于早產(chǎn)兒的以視網(wǎng)膜血管異常增生為特征的視網(wǎng)膜血管疾病，而視網(wǎng)膜缺氧可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜產(chǎn)生血管生成因子，進(jìn)而刺激新生血管形成，臨床上常用ACEI類藥物來抑制其生成[4]。VEGF是連接新生血管形成各個(gè)網(wǎng)絡(luò)的樞紐，其與bcl-2可以相互調(diào)節(jié)促進(jìn)新生血管形成[5]。bax基因本身發(fā)揮促進(jìn)凋亡的效應(yīng)需要與其家族中bcl-2基因相互協(xié)調(diào)形成一個(gè)調(diào)控體系，當(dāng)bax同源二聚體形成時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而bcl-2蛋白表達(dá)量升高時(shí)，bax二聚體逐漸分開，與bcl-2蛋白形成更穩(wěn)定的bax-bcl-2異源二聚體，從而抑制細(xì)胞凋亡[6]。

丹參具有抑制細(xì)胞凋亡、抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基作用，且是一種強(qiáng)抗氧化劑，能升高血清SOD與GSH-PX活性，并降低過氧化物活性，其可能通過打破氧自由基介導(dǎo)的細(xì)胞損傷，抑制脂質(zhì)過氧化物與自由基生成，保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞作用[7-9]。

氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型是視網(wǎng)膜病變和其他異常視網(wǎng)膜血管增生性疾病的主要模型之一，其主要依據(jù)生后第7 天小鼠的視網(wǎng)膜血管發(fā)育最接近早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜血管的特點(diǎn)，將這種小鼠置于高氧環(huán)境中，小鼠的視網(wǎng)膜可出現(xiàn)血管增生等類似人類視網(wǎng)膜病變的改變而建立[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組幼鼠視網(wǎng)膜組織中bax mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，而血清VEGF濃度與視網(wǎng)膜組織中bcl-2 mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組。丹參注射液2 g/kg組血清VEGF濃度及視網(wǎng)膜組織中bcl-2 mRNA表達(dá)水平均明顯低于丹參注射液1 g/kg組，高于丹參注射液4 g/kg組；視網(wǎng)膜組織中bax mRNA表達(dá)水平明顯高于丹參注射液1 g/kg組，低于丹參注射液4 g/kg組；bax mRNA表達(dá)水平與bcl-2 mRNA表達(dá)水平間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

綜上所述，丹參注射液能抑制氧誘導(dǎo)的幼鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞增生，對(duì)視網(wǎng)膜病變等視網(wǎng)膜新生血管疾病的治療可能具有潛在的應(yīng)用前景，為視網(wǎng)膜新生血管疾病的治療提供了一個(gè)新的思路，但目前對(duì)其確切的作用機(jī)制還不明了，有待進(jìn)一步研究。

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Protecting effect of Danshen injection on the oxygen-induced retinopathy in neonatal rats

CAO Meiling,WU Hongmin

(The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001,Liaoning, China)

Abstract:Objective It is to explore the effect of Danshen injection on the expression of apoptosis correlated gene and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the serum in the neonatal rats with oxygen induced retinopathy,and to research the mechanism of inhibiting hyperplasia.Methods 100 neonatal rats (7-day old) were randomly divided into five groups: control group,model group, Danshen injection groups(4, 2,1 g/kg),every group included 20 rats. The rats in control group lived in the environment with normal oxygen.The rats in other groups were used to establish models of retinopathy of prematurity. Model group was given normal saline, Danshen injection groups were given 4, 2, 1 g/kg Danshen injection respectively. After intervention for 5 days, the rats were killed to draw their blood to detect the concentration of VEGF, and to get their retina to determine the expression levels of bax and bcl-2 through RT-PCR. Results The level of bax mRNA in retina tissue in model group was lower while that of bcl-mRNA was higher than that in control group(P<0.05). The content of serum VEGF and the expression of bcl-2 mRNA in 2 g/kg Danshen injection group were lower than that in 1 g/kg Danshen group (P<0.05), but higher than that in 4 g/kg Danshen injection group (P<0.05). The expression of bax mRNA in retina tissue in 2 g/kg Danshen injection group were higher than that in 1 g/kg Danshen group (P<0.05), but lower than that in 4 g/kg Danshen injection group (P<0.05). Bax mRNA expression was negatively related with bcl-2 mRNA (r=-0.653,P<0.05). Conclusion Ginkgo biloba extract can inhibit the hyperplasia induced by oxygen.

Key words:retinopathy of prematurity; Danshen injection; vascular endothelial growth factor; apoptosis

[收稿日期]2015-12-16

[中圖分類號(hào)]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)11-1174-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.11.010

[作者簡(jiǎn)介]曹美玲，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事新生兒疾病方面的研究。[通信作者]吳紅敏，E-mail：whm406@163.com