miR-365通過靶向E2F2抑制胃癌細胞增生和腫瘤形成

郭水龍　朱圣韜　程　芮　邵琳琳　孫秀梅　張澍田

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院消化內科 國家消化系統疾病臨床醫學研究中心 首都醫科大學消化病學系 消化疾病癌前病變北京市重點實驗室，北京 100050)

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miR-365通過靶向E2F2抑制胃癌細胞增生和腫瘤形成

郭水龍朱圣韜程芮邵琳琳孫秀梅張澍田*

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院消化內科 國家消化系統疾病臨床醫學研究中心 首都醫科大學消化病學系 消化疾病癌前病變北京市重點實驗室，北京 100050)

【摘要】目的研究胃癌相關miR-365調控胃癌細胞增生和腫瘤發生的功能，并通過驗證下游靶分子E2F2研究miR-365的作用機制。方法采用Northern blotting法檢測miR-365在小鼠各組織器官中的表達譜；real-time PCR檢測miR-365在人胃癌組織中的表達變化；細胞實驗和裸鼠成瘤實驗研究miR-365過表達對胃癌細胞增生的抑制作用；生物信息學分析miR-365下游靶分子E2F2；構建E2F2 3’UTR 野生型和突變型熒光素酶報告載體，并利用雙熒光素酶活性分析檢測miR-365對E2F2基因表達的調控和結合位點；Western blotting法檢測miR-365對E2F2蛋白表達的調控作用。 結果miR-365在包括胃在內的多種消化道組織中表達； miR-365在人胃癌組織中表達顯著下調；miR-365過表達顯著抑制多種胃癌細胞的增生和裸鼠皮下的成瘤能力；E2F2是miR-365的靶分子，miR-365通過E2F2 3’UTR上的結合位點抑制E2F2的蛋白表達。結論miR-365 在人胃癌組織和小鼠胃癌模型中表達下調，并通過下游靶分子E2F2抑制胃癌細胞增生和腫瘤形成。

【關鍵詞】E2F2；miR-365；胃癌；microRNA

胃癌是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤，名列全球第二大癌癥死亡原因[1]。我國是胃癌高發國，每年新發胃癌患者40萬人，發病率在所有惡性腫瘤中居首位，死亡人數達30萬，約占所有惡性腫瘤死亡人數的25%～30%[2]。miR-365作為一種抑癌miRNA，廣泛參與多種消化道腫瘤的發生、發展[3-5]。E2F家族是調控細胞周期與凋亡的一類重要的轉錄因子，廣泛參與各種組織和器官的腫瘤發生過程[6]。在消化系統腫瘤中，目前對E2F1研究較多，其作為抑癌基因在食管癌、胃癌和結直腸癌中具有重要的診斷價值[7]。目前對E2F2在消化道腫瘤中的功能研究主要集中在結直腸癌，其在胃癌發生中的功能機制仍不清楚。本研究從多個方面證實miR-365可靶向抑制E2F2表達，并抑制胃癌細胞增生和腫瘤形成，揭示了胃癌發生、發展的新的調控機制。

1材料與方法

1.1材料

miR-365 Luciferase報告載體pGL3-CM 由pGL3-control改構而成。AGS、BGC-823、SGC-7901和Ges-1細胞由本實驗室保存。E2F2抗體購自英國Abcam公司。GAPDH抗體和二抗購自中杉金橋公司。各種限制性內切酶和T4多聚核苷酸激酶購自美國NEB公司。Taqman miRNA real-time試劑盒購自美國ABI公司。 miRNA mimic和ASO及相應對照合成自上海吉瑪制藥技術有限公司；引物和探針合成自美國Invitrogen公司。質粒抽提及凝膠回收試劑盒購自德國Qiagen公司，轉染試劑購自美國Invitrogen公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司，其他試劑均為國產分析純。人胃癌標本購自鄭州大學附屬河南腫瘤醫院腫瘤組織標本庫。所有腫瘤標本已經組織學鑒定，標本取得后迅速置于液氮中至RNA和蛋白提取。普通小鼠和裸鼠來自解放軍軍事醫學科學院動物中心，實驗動物許可證號：SYXK(京)2012-0023。

1.2方法

1.2.1Northern blotting法檢測小鼠各器官組織中miR-365的表達

小鼠處死后，提取各器官組織總RNA，根據文獻[8]描述方法進行Northern blotting檢測。具體步驟為：25 μg RNA經電泳、轉膜、固定和預雜交后，與p32標記的 miR-365或U6特異探針室溫雜交過夜，經洗膜后壓片顯影。

1.2.2人胃腺癌組織中檢測miR-365的表達

使用ABI公司的Taqman試劑盒進行miRNA的定量檢測，具體方法是Trizol法提取人胃癌組織中總RNA，經cDNA反轉后，依據說明書進行Real-time PCR。

1.2.3細胞增生檢測

2×104細胞/孔接種到24孔板中，培養24 h后，轉染細胞，使用Lipofectamine 2000進行轉染，miRNA mimic或ASO濃度為50 nmol/L。每組設置4個復孔。轉染72 h后，去除上清，胰蛋白酶消化細胞，完全培養基終止消化。加入臺盼藍染液標記死亡細胞，光鏡下對活細胞計數。

1.2.4裸鼠成瘤實驗

將處于對數增長期的1×106個對照細胞或miR-365穩定轉染的BGC-823細胞分別注射到8只雌性裸鼠(4～5周)的左右背部皮下。飼養4周后處死裸鼠，分離背部皮下腫瘤組織，分別測量左右兩側腫瘤組織的質量。

1.2.5miR-365靶向E2F2的生物信息學預測

使用microRNA在線靶點分析工具TargetScan(www.targetscan.org)分析人E2F2基因3’UTR。1.2.6熒光素酶活性分析檢測miR-365對E2F2的靶向作用

使用上下游引物5′-CCGCTCGAGTTTTCTTTAGGGACCAGG-3′和5′-CCGACGCGTGCAGTTTAATGTTTAATGCC-3′ 擴增人E2F2基因的3’UTR序列，并克隆到 pGL3-CM質粒構建熒光素酶報告載體(野生型)。采用引物5′-CCGGAATTCAATTTTTCAGTGTAGTTTGTTGTT-3′ 和5′-CCGACGCGTCCTCCTTGTATTGAGATAATTG-3′將E2F2 3’UTR的 miR-365潛在結合位點進行突變，構建熒光素酶報告載體(突變型)。將報告載體與miR-365過表達載體共轉染細胞，48 h后裂解細胞，根據試劑說明書進行檢測。檢測儀器為LB 960 Centro XS3 Luminometer。

1.2.7Western blotting蛋白檢測

使用RIPA裂解細胞提取蛋白并檢測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，上樣量為25 μg到50 μg。半干法轉膜，5%(質量分數)脫脂牛奶封閉，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，HRP偶聯二抗室溫孵育1 h，ECL發光顯影。

1.3 統計學方法

2結果

2.1 miR-365在小鼠胃及其他組織中特異表達

Northern blotting檢測結果顯示，miR-365在包括胃在內的多種組織中表達，尤其在胃腸道系統中的胃、食管、小腸和結腸中都有表達，提示miR-365可能在這些組織中具有重要的生理功能(圖1)。

圖1　Northern blotting 檢測miR-365在小鼠組織中的表達譜

2.2人胃腺癌組織中miR-365表達顯著下調

Real-time PCR結果顯示，與對應的癌旁正常組織相比，28例人胃癌組織中，20例明顯下調，下調的比例達到71%。統計結果顯示，人胃癌組織中miR-365的平均表達水平只相當于正常胃組織中的38% (P<0.001，圖2)。這一結果表明，miR-365的下調在人胃癌中較為常見，提示其下調可能與胃癌發生發展相關。

圖2　miR-365在人胃癌組織中表達檢測

2.3過表達miR-365抑制胃癌細胞增生

在3種胃癌細胞系AGS、BGC-823、SGC-7901和1種胃上皮正常細胞系GES-1中瞬時轉染miR-365 mimics，72 h后，與對照組(NC)相比，miR-365過表達明顯抑制4種細胞系的細胞增生，抑制率達35%～50%(P<0.01，圖3)。

2.4過表達miR-365抑制胃癌細胞裸鼠皮下成瘤

裸鼠成瘤實驗結果顯示，右側miR-365過表達組的腫瘤明顯小于左側對照細胞組，證明miR-365可顯著抑制胃癌細胞的成瘤能力(P<0.01，圖4)。

圖3　miR-365過表達抑制胃癌細胞增生

**P<0.01vsNC group； NC:normal control.

圖4　miR-365過表達抑制胃癌細胞的成瘤性

2.5miR-365直接靶向人E2F2基因3’UTR，抑制人E2F2基因的表達

如圖5所示，生物信息學分析發現在人E2F2基因mRNA 3’UTR上存在1處miR-365潛在結合位點，提示miR-365與E2F2之間存在可能的靶向關系。進一步的熒光素酶活性檢測結果顯示， miR-365過表達可以明顯抑制E2F2 3’UTR報告載體的熒光素酶活性，約為對照組的60%(P<0.01)，表明miR-365通過結合3’UTR區可抑制E2F2基因的表達。將預測的miR-365結合位點突變，可顯著消除miR-365過表達導致的熒光素酶活性降低 (P>0.05，圖6)。

圖5　人E2F2 3’UTR 上miR-365結合位點分析

圖6　熒光素酶活性分析檢測各組報告載體表達

*P<0.01vsNC group； NC:normal control.

2.6miR-365抑制E2F2蛋白表達

Western blotting檢測結果顯示，在胃癌細胞AGS中過表達miR-365， E2F2的蛋白表達水平明顯下降，而用ASO敲低BGC-823細胞內源性的miR-365水平后，E2F2表達明顯上調(圖7)。此外，與野生型小鼠相比，在pten基因特異敲除的小鼠胃癌組織中，miR-365表達下調，同時E2F2蛋白表達水平顯著上升(圖8)。這些結果表明，miR-365負向調節E2F2的蛋白表達，E2F2可能是miR-365的直接靶基因。

圖7　Western blotting檢測各組細胞E2F2蛋白表達

圖8　PTEN基因敲除小鼠(PTENfl/fl)胃癌組織中

3討論

MicroRNA (miRNA)是一類22bp左右的非編碼小RNA，通過序列互補與特異mRNA結合，在轉錄后水平調控靶基因的表達，廣泛參與各種腫瘤的發生發展，并在腫瘤診斷和治療方面具有很大的應用前景[9-10]。大量研究[11-14]結果顯示，miR-365在多種腫瘤組織中表達下調，并通過不同靶分子促進腫瘤的增生和遷移。筆者的表達譜實驗結果顯示，miR-365在多種小鼠消化道組織中高表達，提示其可能在消化道腫瘤中發揮了重要作用。而研究結果表明，miR-365的確在人胃癌組織中表達下調，并通過其新的靶分子E2F2促進胃癌細胞增生和腫瘤形成。E2F2是E2F轉錄因子家族的成員，其主要以細胞周期依賴性的模式與視網膜母細胞瘤蛋白pRB結合，調控下游細胞周期與增生相關蛋白的表達[15]。最新的研究[16]結果顯示，E2F1和E2F2共同與P53蛋白維持細胞的穩態，其失衡將導致腫瘤的發生。筆者與國外課題組的前期研究[5， 17-19]結果顯示，miR-365主要通過調控細胞周期抑制腫瘤細胞增生，其主要靶分子為cyclin D1和CDK4/6，而E2F家族則是cyclin D1和CDK4/6下游重要的轉錄因子。新靶分子E2F2的發現，不僅使得miR-365調節腫瘤細胞周期的調控網絡更加完善和精確，也提示該調控網絡在腫瘤發生發展中的重要作用。

隨著個體化精準醫療的興起，國內外研究者都在開發新的胃癌早期診斷標志物和藥物作用靶點，而miRNA和周期調控蛋白是其中的兩大熱點[15， 20-23]。本研究的結果為胃癌早期篩查和治療提供了新的潛在靶分子，并為下一步的臨床研究奠定了基礎。

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編輯陳瑞芳

miR-365 inhibited the proliferation and tumorigenicity of gastric cancer cells by targeting E2F2

Guo Shuilong， Zhu Shengtao， Cheng Rui， Shao Linlin， Sun Xiumei， Zhang Shutian*

(DepartmentofGastroenterology，BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity;NationalClinicalResearchCenterforDigestiveDiseases;FacultyofGastroenterologyofCapitalMedicalUniversity;BeijingKeyLaboratoryforPrecancerousLesionofDigestiveDiseases，Beijing100050，China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the regulatory role of miR-365 on proliferation and tumorigenicity of gastric cancer cells， and explore the functional mechanism of miR-365 by verifying its target molecule E2F2 protein. MethodsThe expression profile of miR-365 in mouse tissues was checked by Northern blotting. The expression of miR-365 in human gastric cancer tissues was detected by Real-Time PCR. The regulatory role of miR-365 on gastric cancer cell proliferation and tumorigenicity were explored with cells experiment and nude mouse tumorigenicity assay; The potential binding site of miR-365 in the E2F2 3′ untranslated region (3′UTR) was predicted with the bioinformatic tools; The luciferase report plasmids containing the wild type and mutated binding site of E2F2 3′UTR were constructed， and were used to study the regulation mechanism and identify the binding sites of miR-365 by luciferase activity analysis; The regulation effect of miR-365 on E2F2 protein expression was checked by Western blotting. Results The specific expression of miR-365 was detected in various digestive tissues including stomach; miR-365 was down-regulated in human gastric cancer tissues; miR-365 inhibited the expression of E2F2 protein by recognizing the specific binding site on the 3′UTR of E2F2 mRNA. ConclusionmiR-365 was down-regulated in gastric cancer tissues of human and mouse model， and suppressed the proliferation and tumorigenicity of gastric cancer cells by inhibiting the expression of E2F2.

【Key words】E2F2; miR-365; gastric cancer; microRNA

(收稿日期：2015-12-25)

【中圖分類號】R 735.2

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.001]

*Corresponding author， E-mail：zhangshutian@ccmu.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金(81302160， 81272447)，國家消化系統疾病臨床醫學研究中心基金(2015BAI13B09)，北京市自然科學基金(7152043)。 This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81302160， 81272447)， National Clinical Research Center for Digestive Diseases (2015BAI13B09)， Natural Science Foundation of Beijing (7152043).

網絡出版時間：2016-01-2714∶37網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20160127.1437.002.html

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