血清饑餓激活表皮生長因子受體誘導胃癌耐藥

王俊雄　蔡習強　聶勇戰(zhàn)　郝建宇　樊代明*

(1. 第四軍醫(yī)大學西京消化病醫(yī)院， 西安 710032；2.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院醫(yī)療保健中心， 北京100050；3. 首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100431；4.國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心，北京 100050；5.首都醫(yī)科大學消化病學系，北京 100050)

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血清饑餓激活表皮生長因子受體誘導胃癌耐藥

王俊雄1，2，3，4，5蔡習強1聶勇戰(zhàn)1郝建宇3，4，5*樊代明1*

(1. 第四軍醫(yī)大學西京消化病醫(yī)院， 西安 710032；2.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院醫(yī)療保健中心， 北京100050；3. 首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100431；4.國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心，北京 100050；5.首都醫(yī)科大學消化病學系，北京 100050)

【摘要】目的探討血清饑餓對表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)高表達胃癌細胞化學藥物治療(以下簡稱化療)敏感性的影響及其作用機制。方法將胃癌細胞分為4組：正常對照組、饑餓組、化療藥處理組、饑餓+化療藥處理組。采用噻唑藍[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]方法觀察腫瘤細胞的存活率，兩兩比較驗證血清饑餓對化療藥敏感性的影響。采用Western blotting法觀察細胞EGFR及其下游靶分子細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases， ERK)，蛋白激酶B(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase， Akt)的磷酸化水平變化；最后進一步借助EGFR單克隆抗體西妥昔單抗抑制EGFR的磷酸化的活性，觀察其對胃癌細胞化療感性的影響。結(jié)果與對照組相比，胃癌細胞SGC7901血清饑餓時對多種化療藥物的敏感性下降，血清饑餓可促進EGFR、ERK磷酸化，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。EGFR單克隆抗體可部分逆轉(zhuǎn)血清饑餓所導致的化療藥耐藥。 結(jié)論缺營養(yǎng)饑餓可誘導EGFR高表達胃癌細胞化療耐藥，其誘導機制可能與激活EGFR/ERK信號通路有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】胃癌；血清饑餓；表皮生長因子受體；耐藥

大多數(shù)晚期腫瘤應用最廣泛的治療策略是化學藥物治療(以下簡稱化療)，但是并隨著藥物的使用出現(xiàn)腫瘤耐藥，導致僅有部分的腫瘤化療有效[1]。傳統(tǒng)研究[2]認為進行化療的腫瘤患者應該高營養(yǎng)飲食來抵抗化療帶來的不良反應，近年研究[3]表明短期饑餓可以影響多種腫瘤對化療藥物的敏感性，不同種類的腫瘤化療藥物的敏感性的影響不盡相同。這樣針對不同腫瘤患者為其制定個體化的營養(yǎng)方案就可以擴大特定化療藥物對腫瘤的有效性，具有實際的臨床意義。胃癌是我國死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤之一，因此進一步深入研究血清饑餓對胃癌化療藥敏感性的作用，為胃癌患者臨床營養(yǎng)支持治療提供新思路等具有重要意義。

1材料和方法

1.1 材料

人胃癌SGC7901、BGC823、MKN45細胞系(購自中國軍事醫(yī)學科學院)，胎牛血清(美國Gibco公司)；RPMI-1640 培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；MTT(美國Sigma公司)；表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、phospho-EGFR、(extracellular regulated protein kinases， ERK)、phospho-ERK、Akt、phospho-Akt抗體(美國Cell Signaling公司)；辣根酶過氧化物標記的二抗(美國Santa Cruz 公司)；西妥昔單抗(美國Merk公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及藥物處理

人胃癌SGC7901、BGC823、MKN45細胞系培養(yǎng)環(huán)境相似，為37 ℃、5% (體積分數(shù))CO2的孵箱。培養(yǎng)液為含10%(體積分數(shù))胎牛血清的RPMI1640，西妥昔單抗?jié)舛葹?00 μg/ mL。

1.2.2MTT法檢測細胞體外藥物敏感性

取5×103個細胞，均勻種植于Corning公司的96孔板中，分正常對照組、饑餓組、化療藥處理組、饑餓+化療藥處理組，24 h后將表柔比星(epirubicin，EPI)(0.5 μg/mL)和順鉑(cis-diaminedichloroplatinum，CDDP)(0.8 μg/mL)，五氟尿嘧啶[5-fluoro-2，4(1H，3H)pyrimidinedione，5-FU](0.8 μg/mL)等藥物或空白對照加入細胞中，每個濃度設(shè)置5個復孔。培養(yǎng)48 h后，向96孔板的每個孔小心加入5 mg/mL的預制MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h。小心吸出96孔板孔內(nèi)液體，加入150 μL二甲基亞砜，振蕩器上震搖10 min，使用酶標儀在490 nm波長處讀出各孔的吸光度值。根據(jù)所得結(jié)果，以對照組的吸光度值為參照，計算與對照組的比值并繪制藥物濃度抑制曲線。

1.2.3Western blotting 法分析蛋白表達

不同條件處理胃癌細胞后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，把PBS 液吸取干凈后，加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和細胞裂解液，冰上孵育15 min，用細胞刮將細胞刮下收集到1.5 mL的EP管中，4 ℃，12 000r/min離心10 min，吸取上清至另一EP管。檢測蛋白濃度，100 ℃煮沸10 min，冷凍保存?zhèn)溆谩８鹘M樣品采取總蛋白30 μg，經(jīng)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗過夜，次日加入辣根酶過氧化物標記的二抗，室溫孵育1 h，加入發(fā)光底物，用Bio-Rad成像系統(tǒng)對化學發(fā)光信號進行圖像采集，采用Quantity One 軟件比較樣本目的蛋白表達水平高低。

1.2.4熒光共聚焦顯微鏡檢測phospho-EGFR

取處于生長對數(shù)期的胃癌細胞SGC7901，于熒光小室中鋪細胞，分別正常培養(yǎng)和血清饑餓24 h，細胞孔中分別加入PBS洗3次，每次5 min；加入4%(體積分數(shù))多聚甲醛在室溫下固定30 min，吸出多聚甲醛，PBS緩沖液漂洗；1 mL 0.1%(體積分數(shù)) Triton 室溫下處理5 min；3%(體積分數(shù))胎牛血清封閉液封閉35 min，接著PBS漂洗1次；加入一抗，37 ℃孵育1 h；加入二抗，37 ℃避光孵育2 h；加入DAPI，室溫下反應10 min； 熒光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。

1.3統(tǒng)計學方法

2結(jié)果

2.1永生化的胃正常細胞和胃癌細胞系中EGFR的表達情況

在永生化的胃正常細胞GES中EGFR相對低表達，而在胃癌細胞系A(chǔ)GS、MKN45、SGC7901中為相對高表達(圖1)。為了驗證胃癌細胞系在缺營養(yǎng)狀態(tài)在對化療藥物敏感性，本研究選擇MKN45、SGC7901進行下一步試驗。

2.2血清饑餓導致胃癌細胞對化療藥物敏感性下降

在0.5%(體積分數(shù))血清濃度下，胃癌腫瘤細胞可維持基本生長，但生長相對緩慢，所以設(shè)置血清濃度0.5%(體積分數(shù))為血清饑餓條件。采用MTT法檢測血清饑餓時EGFR高表達的胃癌細胞MKN45和SGC7901對化療藥物的敏感性下降(圖2)實驗分組分別為：Ctrl組(對照組)、血清饑餓組、化療藥組、血清饑餓+化療藥組。預先鋪于96孔板中的MKN45細胞和SGC7901細胞中，每組設(shè)5重復，48 h后按MTT法處理，觀察腫瘤細胞的存活率，提示血清饑餓時胃癌細胞在相同濃度的化療藥物(5-FU、CDDP、EPI)作用下，細胞存活率較對照組升高，經(jīng)統(tǒng)計學處理其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1　EGFR在胃正常細胞及腫瘤細胞中的表達

圖2　不同條件下胃癌細胞存活率

A：serum starvation reduces the role of 5-FU in MKN45 cells；B：serum starvation reduces the role of CDDP in MKN45 cells；C： serum starvation reduces the role of EPI in MKN45 cells；D:cetuximab could partially reverse 5-FU resistance induced by serum starvation. E：cetuximab could partially reverse CDDP resistance induced by serum starvation. F: cetuximab could partially reverse EPI resistance induced by serum starvation.*P<0. 05； Ctrl: control；S: serum starvation；C: cetuximab；S/C: serum starvation +Cetuximab；EPI：epirubicin； CDDP：cis-diaminedichloroplatinum; 5-FU：5-fluoro-2，4(1H，3H)pyrimidinedione.

2.3血清饑餓激活EGFR/ERK通路

胃癌細胞SGC7901隨著血清饑餓時間延長，對EGFR/ERK通路的活化作用越強。在血清饑餓12 h EGFR的磷酸化水平明顯升高，同時下游的ERK分子磷酸化也隨之升高，但Akt的磷酸化水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。同時進行免疫熒光顯示，血清饑餓時EGFR的磷酸化水平明顯升高(圖4)。

圖3　血清饑餓激活EGFR/ERK通路

Expression of EGFR， p-EGFR， p-Akt， p-ERK protein of SGC7901 cells treated with serum starvation time-dependently analyzed by Western blotting，n=6.**P<0. 01vsgroup of 0 h；EGFR:epidermal growth factor receptor；ERK:extracellular regulated protein kinases.

圖4　免疫熒光檢測血清饑餓時EGFR的激活

2.4EGFR單克隆抗體可部分逆轉(zhuǎn)血清饑餓所致的胃癌細胞化療耐藥

在胃癌細胞SGC7901中，血清饑餓能促進EGFR磷酸化，應用西妥昔單抗能部分抑制EGFR的激活(圖5)。同時MTT實驗結(jié)果顯示西妥昔單抗使得化療藥的敏感性有所恢復。實驗分組分別為：對照組，血清饑餓組，西妥昔單抗，血清饑餓+西妥昔單抗組。相同濃度的化療藥物，血清饑餓組的胃癌細胞存活率高于對照組，而血清饑餓同時聯(lián)用西妥昔單抗，能使得化療藥敏感性得到部分恢復(圖2D、E、F)。

2.5血清饑餓能拮抗化療藥物對EGFR/ERK通路的抑制

為了進一步明確EGFR/ERK信號通路是否參與了血清饑餓誘導的化療耐藥的過程，本研究實驗分組分別為：對照組，血清饑餓組，化療藥組，血清饑餓+化療藥組。Western blotting提示單純應用化療藥物(EPI，5FU)可以顯著抑制EGFR和其下游的ERK的磷酸化，并顯著減少(P<0.05，圖6)。血清饑餓同時加用化療藥物時可部分恢復EGFR下游的ERK的磷酸化水平。

3討論

腫瘤化療藥耐藥目前成為腫瘤治療的最大難題之一。近年來大量研究[4-6]顯示EGFR異常活化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、增生與轉(zhuǎn)移、放化療敏感性、腫瘤耐藥性和不良預后顯著相關(guān)[4]。Yoon等[5]發(fā)現(xiàn)膽管上皮

圖5　西妥昔單抗抑制血清饑餓誘導的EGFR磷酸化

Expression of EGFR and p-EGFR protein in SGC7901cells treated with serum starvation and Cetuximab analyzed by Western blotting: β-actin was used as a loading control，n=6.**P<0. 01vscontrol；EGFR:epidermal growth factor receptor.

圖6　血清饑餓能拮抗化療藥物對EGFR/Erk通路的抑制

n=6.**P<0. 01vscontrol， Ctrl: control；S: serum starvation；D: drug；S/D: serum starvation + drug；EGFR:epidermal growth factor receptor；ERK:extracellular regulated protein kinases； EPI：epirubicin； CDDP: cis-diaminedichloroplatinum； 5-FU5-fluoro-2，4(1H，3H)pyrimidinedione.

細胞癌敏感細胞株中EGFR活性低于耐藥細胞株。另一研究[6]發(fā)現(xiàn)肝癌多藥耐藥與表皮因子激活一系列的酪氨酸激酶有關(guān)，而且EGFR抑制劑能恢復耐藥肝癌細胞的化療藥物敏感性。還有研究[7]報道在多藥耐藥的乳腺癌中EGFR通過調(diào)控細胞周期從而降低化療藥物敏感性。

近期的研究[2]表明在黑素瘤、膠質(zhì)瘤、乳腺癌細胞中，周期性饑餓可以有效地延緩腫瘤進展并提高化療藥物的有效性。但是另有研究[3]發(fā)現(xiàn)缺營養(yǎng)情況下肝癌細胞自噬增加，聯(lián)用自噬抑制劑后對肝癌細胞化療藥物的敏感性降低。研究[4]表明自噬不但是肝癌細胞在缺營養(yǎng)情況下的生存機制之一，同時也有助于肝癌細胞抵抗化療的作用。本課題組研究發(fā)現(xiàn)高表達EGFR胃癌細胞血清饑餓后，與對照組相比，腫瘤細胞對化療藥物敏感性顯著下降。同時發(fā)現(xiàn)隨著饑餓時間的延長EGFR的磷酸化程度逐漸升高，而腫瘤細胞處于饑餓加EGFR單克隆抗體后化療敏感性有所恢復。提示EGFR的活化可能參與血清饑餓誘導的胃癌多藥耐藥。

ERK信號通路是EGFR重要的下游信號傳導通路，ERK是MAPK家族成員之一，包括ERK1及ERK2。ERK發(fā)揮抑制細胞凋亡，促進細胞增生的作用[8-10]。在特定的癌癥中，ERK通路的激活情況可以調(diào)節(jié)藥物泵和抗凋亡的分子如Bcl-2的表達。Bcl-2抗凋亡分子和Mdr-1藥物泵蛋白轉(zhuǎn)錄表達增加的可能原因是ERK通路下游靶激酶磷酸一些轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合Mdr-1和Bcl-2和的啟動子區(qū)，刺激目的分子轉(zhuǎn)錄增加[11-13]。Mdr-1和Bcl-2表達的增加使得腫瘤細胞耐藥性增強[14-16]。本研究中發(fā)現(xiàn)血清饑餓可以促進EGFR磷酸化，同時隨著血清饑餓時間的延長下游的ERK的磷酸化水平也明顯升高。腫瘤細胞給予化療藥時，與正常對照相比ERK的磷酸化水平相對較低，但血清饑餓的同時給予化療藥物，ERK磷酸化水平處于相對高水平。因此，胃癌細胞正常情況下，EGFR活化處于相對低的狀態(tài)，而在饑餓狀態(tài)腫瘤細胞EGFR自身磷酸化，二聚體改變，通過EGFR/ERK大通路誘發(fā)化療藥耐藥，EGFR單克隆抗體使得化療藥物的敏感性有所恢復。

腫瘤細胞經(jīng)常處于饑餓或缺氧狀態(tài)，胃癌細胞血清饑餓有可能是其化療藥耐藥的原因之一[17-18]。血清饑餓誘導胃癌細胞化療耐藥的機制可能與激活EGFR信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)。以上結(jié)果僅是體外實驗，還需要通過動物實驗進一步證實以上結(jié)果。

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編輯慕萌

Serum starvation induces gastric carcinoma chemotherapy resistance through EGFR/ERK pathway

Wang Junxiong1，2，3，4，5，Cai Xiqiang1，Nie Yongzhan1，Hao Jianyu3，4，5*，F(xiàn)an Daiming1*

(1.XijingHospitalofDigestiveDiseases，XijingHospital，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710032，China；2MedicalandHealthCenter，BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China; 3.DepartmentofGastroenterology，BeijingChaoyangHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100043，China；4.NationalClinicalResearchCenterforDigestiveDiseases，Beijing100050，China; 5.FacultyofGastroenterology,CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China)

【Abstract】Objective To demonstrate drug resistance induced by serum starvation in gastric cancer and explore the possible mechanism.MethodsThe viability of SGC7901 cells was measured by MTT assay. The inhibition rates and IC50 values were then calculated. The phosphorylation level of EGFR and ERK induced by serum starvation were measured by Western blotting. ResultsSerum starvation could reduce the action of chemotherapeutic drug. EGFR signal activation acted as a protective factor against starvation by regulating downstream genes. Compared with the control group， the phosphorylation levels of EGFR and ERK were significantly increased in serum starvation treatment group (P<0. 05). EGFR monoclonal antibody could partially reverse multiple drug resistance as a result of serum starvation. ConclusionSerum starvation may induce drug resistance in gastric cancer cell and the mechanism may be related to the activation of EGFR/ERK signaling pathway.

【Key words】gastric cancer； serum starvation； epidermal growth factor receptor(EGFR)； drug resistance

(收稿日期：2015-12-25)

【中圖分類號】R 656.6

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.005]

*Corresponding author， E-mail：daimingfan@fmmu.edu.cn， haojianyu@sina.com

基金項目：國家自然科學基金(81120108005， 81172096)，國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心基金(2015BAI13B09)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81120108005， 81172096), National Clinical Research Center for Digestive Diseases (2015BAI13B09).

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-01-2716∶09網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20160127.1609.006.html

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