枸杞多糖通過調控PI3K/Akt/eNOS信號通路對去卵巢大鼠心肌產生抗氧化作用*

于 寧， 楊 芳, 冷 雪， 張 妮， 王俊巖， 宋 囡△

(1遼寧中醫藥大學第一臨床學院， 2遼寧中醫藥大學中醫臟象理論及應用教育部重點實驗室, 3遼寧省中醫轉化醫學研究中心， 4遼寧中醫藥大學附屬第二醫院, 遼寧 沈陽 110847)

枸杞多糖通過調控PI3K/Akt/eNOS信號通路對去卵巢大鼠心肌產生抗氧化作用*

于 寧1， 楊 芳4, 冷 雪2,3， 張 妮2,3， 王俊巖2,3， 宋 囡2,3△

(1遼寧中醫藥大學第一臨床學院，2遼寧中醫藥大學中醫臟象理論及應用教育部重點實驗室,3遼寧省中醫轉化醫學研究中心，4遼寧中醫藥大學附屬第二醫院, 遼寧 沈陽 110847)

目的： 觀察枸杞多糖對去卵巢大鼠心肌PI3K/Akt/eNOS信號通路的影響。方法: 將30只SD雌性大鼠隨機分為假手術組、去卵巢組、補佳樂組、枸杞多糖高劑量組及枸杞多糖低劑量組，ELISA法比較各組血清雌激素、LDH及CK水平，檢測心肌H2S含量及氧化應激損傷相關指標，HE染色觀察各組心肌的形態變化，Western blot法檢測各組大鼠心肌eNOS蛋白及PI3K/Akt通路蛋白的表達。結果: 與假手術組相比，去卵巢組大鼠血清雌二醇水平降低，心肌H2S含量和GSH-Px活性下降，心肌eNOS蛋白及PI3K/Akt通路蛋白的表達均有所降低，心肌ROS活性和MDA含量升高(P<0.05)，心肌細胞排列紊亂，細胞間隙增大，血清LDH和CK活性均增多；與去卵巢組比較，枸杞多糖高劑量組大鼠血清雌二醇含量增加(P<0.05)，心肌H2S含量、GSH-Px活性、eNOS蛋白及Akt磷酸化水平均提高，心肌ROS活性和MDA含量下降(P<0.05)，血清LDH和CK活性均降低，并且改善大鼠心肌形態的變化。結論: 枸杞多糖可以通過調控PI3K/Akt/eNOS通路改善去卵巢大鼠心臟變化防治絕經后心血管病變。

枸杞多糖； 去卵巢大鼠； 心血管疾病； PI3K/Akt/eNOS信號通路

女性絕經后心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)的患病風險極高，可達育齡期女性的3～4倍[1]。因此近半個世紀以來雌激素替代治療(hormone replacement therapy，HRT)應用于圍絕經期、絕經期及絕經后婦女。長期應用傳統的HRT雖然可以改善絕經期綜合征但卻存在副作用，如誘發子宮內膜癌、乳腺癌等疾病的發生[2-4]，因此植物雌激素作為天然的雌激素替代品倍受關注。

近年來，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)對心臟的損傷作用越來越引起人們的重視。正常組織在氧化代謝中會產生少量的自由基，當一些損傷因素的起作用時，細胞內氧化代謝產物增加，造成ROS堆積，對細胞產生毒性，稱為氧化應激[5]。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP)作為植物雌激素可以通過抑制氧化應激對心臟起到保護的作用[6]，但其具體機制尚未完全闡明。研究發現PI3K/Akt信號通路在氧化應激引起的組織損傷中發揮了重要作用[7]。本課題通過研究枸杞多糖對PI3K/Akt信號通路的調控及對去卵巢大鼠心肌的抗氧化作用，探討枸杞多糖防治絕經后心血管疾病的分子生物學機制，為中醫中藥在臨床中的應用提供理論基礎。

材 料 和 方 法

1 試劑及儀器

枸杞多糖(天然原料匯)；補佳樂(戊酸雌二醇片；Bayer)；大鼠雌二醇ELISA試劑盒及大鼠硫化氫(H2S)ELISA試劑盒(杭州聯科)；大鼠乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)及肌酸激酶(creatine kinase，CK)ELISA試劑盒(IBL)；一氧化氮(nitric oxide，NO)、ROS、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(南京建成)；抗PI3K、Akt和p-Akt抗體(CST)；抗內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抗體(博奧森)；BCA蛋白測定試劑盒(北京鼎國昌盛)；凝膠制備試劑盒(武漢博士德)；三(羥甲基)氨基甲烷、甘氨酸和十二烷基硫酸鈉(Genview)；TBS緩沖液(武漢博士德)。低速冷凍離心機和Multiskan FC型酶標儀(Thermo)；微型垂直電泳槽HE-180和轉移電泳槽VE-1861(上海天能)。

2 實驗動物、模型建立及分組給藥

健康成年無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠30只，平均體質量(200±10)g，10～12 周齡，購于遼寧長生生物技術有限公司，于遼寧中醫藥大學實驗動物中心飼養，自由飲食。在大鼠熟悉環境1周以后，開始每日2次隨機抓取大鼠行陰道細胞學檢查，共12 d(包括術前4 d和術后8 d)，根據陰道細胞形態判斷大鼠動情周期存在狀態[8]。

將上述雌性SD大鼠用10% 水合氯醛(0.3 mL/g)腹腔注射麻醉，俯位固定，在背部脊柱兩側切口，在無菌條件下摘除雙側卵巢(ovariectomized，OVX)。1周后將存活的大鼠隨機分為5組，每組6只：假手術(sham)組(僅摘除雙側小塊脂肪)、OVX組(單純摘除雙側卵巢)、陽性對照戊酸雌二醇(estradiol valerate,Est)組(摘除雙側卵巢1周后，連續12周經口給予戊酸雌二醇0.105 mg·kg-1·d-1)、高劑量LBP(LBP-H)組和低劑量LBP(LBP-L)組(摘除雙側卵巢1周后，連續12周經口給予枸杞多糖，劑量分別為250和125 mg·kg-1·d-1)。Sham組和OVX組均經口給予等量生理鹽水。

3 實驗方法

3.1 血清雌二醇、NO、LDH及CK的檢測 血清雌二醇、LDH及CK用ELISA法檢測，具體操作參照各自說明書。NO按照試劑盒說明書，分別設計標準孔及對照孔，在酶標儀上450 nm處檢測，將標準孔結果繪制標準曲線，將各組實驗數據帶入標準曲線算出結果。

3.2 心肌勻漿后檢測H2S、ROS、MDA、GSH-Px及SOD水平 首先用生理鹽水將心肌組織勻漿，制備為10%心肌勻漿液，然后按照大鼠H2S ELISA試劑盒說明書，分別設計標準孔及對照孔，將標準孔結果繪制標準曲線，將各組實驗數據帶入標準曲線算出結果，心肌組織ROS、MDA、GSH-Px及SOD的檢測分別根據試劑盒說明書，分別設計標準孔及對照孔，在酶標儀上檢測后計算結果。

3.3 心臟HE染色 取大鼠心臟組織， 4%多聚甲醛固定72 h，按蘇木素-伊紅(HE)染色常規方法進行， 70%～100%梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(切片厚度5 μm)、貼片、烤片后，用二甲苯脫蠟、70%～100%梯度乙醇復水、蘇木精染色、70% 鹽酸乙醇分色、伊紅復染，再用 70%～100% 梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，石蠟包埋，光學顯微鏡下觀察。

3.4 Western blot法檢測PI3K、Akt、p-Akt和eNOS的蛋白水平 用蛋白裂解液提取各組心肌組織蛋白，利用BCA蛋白定量測定試劑盒對蛋白進行定量。以50 μg蛋白/泳道上樣，經SDS-PAGE電泳后，電轉移至PVDF膜，加入 I 抗，4 ℃封閉過夜，TBST洗滌10 min 3次，加入HRP標記的II抗。暗室中加發光液并進行曝光。X光片顯影和定影后利用凝膠自動分析成像軟件掃描分析結果，以β-actin為內參照，對蛋白條帶進行相對定量分析。

4 統計學處理

計量數據采用SPSS 16.0軟件處理，用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行分析，各組均數間兩兩比較采用Turkey檢驗，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠血清雌二醇、NO含量及心肌H2S含量的變化

與sham組比較，OVX組大鼠血清雌二醇和NO含量均減少(P<0.05)；與OVX組比較，LBP-H組雌二醇的含量顯著增加，各治療組大鼠血清NO含量存在升高的趨勢，但差異無統計學顯著性。與sham組比較，OVX組大鼠心肌組織H2S含量明顯減少(P<0.01)；與OVX組比較，LBP-H組、LBP-L組及Est組H2S的含量均顯著增加(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠血清雌二醇、NO及心肌H2S含量的變化

Table 1.The serum levels of estradiol and NO, and the myocardial level of H2S in each group (Mean±SD.n=6)

GroupEstradiol(ng/L)NO(μmol/L)H2S(ng/L)Sham102.92±5.1512.48±1.9958.77±8.49OVX88.74±4.91*10.66±1.09**38.28±9.62**Est98.33±5.6810.24±0.5956.40±5.37▲▲LBP-H102.98±8.69▲10.65±1.0155.86±7.38▲▲LBP-L96.48±7.9910.41±0.7258.33±7.02▲▲

*P<0.05,**P<0.01vssham group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsOVX group.

2 各組大鼠心肌ROS、MDA、GSH-Px及SOD水平的變化

與sham組比較，OVX組大鼠心肌ROS和MDA含量均增多(P<0.01)；與OVX組比較，Est組及LBP-H組ROS和MDA含量顯著降低。與sham組比較，OVX組大鼠心肌GSH-Px活性明顯降低(P<0.01)；與OVX組比較，Est組及LBP-H組GSH-Px活性顯著增高。另外，各組大鼠心肌組織SOD活性的差異并無統計學顯著性，但其變化趨勢與GSH-Px活性的變化一致，見圖1。

Figure 1.The myocardial levels of ROS, MDA, GSH-Px and SOD in each group. Mean±SD.n=6.**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsOVX group.

圖1 各組大鼠心肌ROS、MDA、GSH-Px及SOD含量的比較

3 各組大鼠心肌形態的觀察

鏡下可見，各組大鼠心肌組織行HE染色后，與sham組相比，OVX組大鼠心肌細胞排列紊亂，細胞間隙增大；Est組及LBP-H組的上述情況有改善，LBP-L組則對心肌形態的改變不顯著，見圖2。

Figure 2.Histopathological observation of the cardiac tissues (HE staining, ×200). A: sham group; B: OVX group; C: Est group; D: LBP-H group; E: LBP-L group.

圖2 各組大鼠心肌形態的觀察

4 各組大鼠血清LDH和CK活性的變化

與sham組比較，OVX組大鼠血清LDH和CK活性均升高(P<0.01)；與OVX組比較，Est、LBP-L和LBP-H組LDH和CK活性顯著降低(P<0.01),見圖3。

Figure 3.The activity of LDH and CK in each group. Mean±SD.n=6.**P<0.01vssham group;△△P<0.01vsOVX group.

圖3 各組大鼠血清LDH和CK含量的比較

5 各組大鼠心肌組織eNOS蛋白的表達

與sham組比較，OVX組大鼠心肌組織的eNOS蛋白表達明顯減低(P<0.01)；與OVX組比較，LBP-H組及Est組心肌組織eNOS蛋白的表達均顯著提高(P<0.05)，見圖4。

6 各組大鼠心肌組織PI3K/Akt通路蛋白的變化

與sham組比較，OVX組大鼠心肌組織PI3K蛋白的表達及Akt蛋白的磷酸化水平明顯減低(P<0.01)；與OVX組比較，LBP-H組及Est組心肌組織PI3K蛋白的表達及Akt蛋白的磷酸化水平均顯著提高(P<0.05)，見圖5。

討 論

近年來，雌激素是否對心臟有保護作用已逐漸成為研究者關注的焦點。研究表明，雌激素可通過影響脂類代謝、糖代謝、血管反應性、凝血和抑制動脈粥樣硬化等途徑減少心血管疾病的危險性，從而預防心肌缺血和心力衰竭[9]；雌激素也可直接作用于心肌，調節心肌細胞代謝，增強心肌功能[10]。即使在缺血、缺氧狀態下雌激素也具有心肌保護作用，雌激素能降低心肌缺血誘發的心率失常，減少心肌壞死和梗塞面積[11]，促進再灌左心室功能的恢復[12]。

Figure 4.The protein expression of eNOS in each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssham group;△P<0.05vsOVX group.

圖4 各組大鼠心肌組織eNOS蛋白的表達

Figure 5.The protein levels of PI3K and p-Akt in each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssham group;△P<0.05,△△P<0.01vsOVX group.

圖5 各組大鼠心肌組織PI3K及p-Akt蛋白水平的比較

目前研究表明氧化應激在心肌梗死、心肌重塑、心力衰竭等過程中具有重要病因學意義[13]，在這些病理過程中，心肌細胞氧自由基產生不斷增加，會引起細胞內蛋白質、脂質大分子、酶類及 DNA 的氧化損傷，導致能量代謝的變化，而致細胞凋亡和壞死[14]。女性進入絕經期后,其生理機能逐漸衰退,活性氧生成增加,伴隨清除能力下降,氧自由基攻擊生物膜,使膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化[15]。SOD和GSH-Px則是抗氧化系統中的重要組成部分，因此組織中SOD和GSH-Px活性的變化，可以動態地體現機體的抗氧化能力。李政媛等[16]研究發現去卵巢組大鼠心肌T-SOD和GSH-Px的活性明顯減弱，經維生素E治療模型大鼠心肌的抗氧化能力有所恢復，說明維生素E可提高絕經后大鼠心肌抗氧化能力,其主要抗氧化作用是通過增加體內雌激素水平,通過雌激素途徑發揮的。明確了絕經后大鼠心肌組織的氧化應激平衡系統被破壞，同時確定了雌激素對絕經后心臟的保護機制與氧化應激存在密切的關系。本實驗結果發現，大鼠去卵巢12周后，其心肌ROS 和MDA含量明顯增加，GSH-Px活性明顯下降，說明氧化應激系統的平衡被破壞，這一結果與之前的報道保持一致，在此基礎上，我們課題組發現經高劑量枸杞多糖干預后，去卵巢大鼠心肌ROS 和MDA含量有所下降，GSH-Px活性明顯升高，由于活性氧本身在體內能產生破壞性更強的羥自由基,少量就能誘導多種細胞凋亡。本實驗發現絕經后大鼠心肌ROS明顯升高的前提下，高劑量枸杞多糖對心肌細胞的保護作用可能與大劑量的枸杞多糖解除了SOD-H2O2復合物中的H2O2而使 SOD活性增加有關，提示枸杞多糖對去卵巢大鼠心肌的保護作用，可以通過其植物雌激素作用抑制氧化應激來實現。

PI3K 是一種細胞內磷脂酰肌醇激酶，其被激活后可以產生第二信使 PIP3，然后與細胞內含有 PH 結構域的信號蛋白Akt結合，促進Akt的磷酸化。Akt能夠參與細胞內多種細胞途徑并調控多種細胞過程，在調節各種生長因子和其它胞外刺激誘導的心肌細胞存活、生長、增殖、保持功能和營養物質代謝上發揮了重要作用[17-18]。在氧化應激的過程中發揮重要的作用。硫化氫氣體自被發現具有類似一氧化氮和一氧化碳的某些生理作用后，在心血管、神經、消化等多個系統受到諸多關注，內源性H2S發揮舒張血管、調節血壓的效應在NO存在的條件下能夠明顯增強[19]。PI3K上調Akt的磷酸化以激活內皮型一氧化氮合酶，是調控內源性NO合成的最經典途徑之一。基于以上理論，我們推測枸杞多糖可能通過調控PI3K/Akt信號通路影響去卵巢大鼠的心肌的改變。實驗結果表明將大鼠摘除雙側卵巢3個月后，明顯出現了血清雌激素水平的下降，給予補佳樂及高劑量枸杞多糖后，血清雌二醇水平雖然未達到正常水平，但得以明顯改善；造模后大鼠出現了心肌細胞排列紊亂，細胞間隙增大，心肌組織的LDH和CK含量有所升高，說明去卵巢大鼠出現了心肌損傷，并且補佳樂及高劑量枸杞多糖可以改善以上情況，說明枸杞多糖可以通過其植物雌激素作用對絕經后大鼠心臟起到保護的作用；同時實驗結果表明，模型大鼠血清NO及心肌組織H2S也發生了變化，枸杞多糖可以提高模型大鼠H2S的含量，但不能糾正NO的改變，提示我們枸杞多糖可以通過改善心肌H2S的含量而影響心臟血管的舒張功能而保護心肌細胞的病變。與此同時，我們還發現枸杞多糖可以提高去卵巢大鼠心肌eNOS蛋白及PI3K蛋白的表達和Akt蛋白的磷酸化水平，并且與補佳樂無明顯差異，說明枸杞多糖對絕經后心血管疾病可以起到防治作用，部分機制可能是通過調控PI3K/Akt/eNOS通路、影響H2S的含量而發揮作用，與氧化應激也存在密切的關系，但這一過程錯綜復雜，尚待研究。

[1] Rossouw JE, Anderson GL, Prentice RL, et al. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmeno-pausal women: principal results from the Women’s Health Initiative randomized controlled trial[J]. JAMA, 2002, 288(3):321-333.

[2] 林莉芬.小劑量雌激素治療圍絕經期綜合征療效分析[J]. 藥物與臨床，2012，19(6):65-67.

[3] 閆 丹，阮祥燕. 不同雌孕激素對絕經婦女心血管影響的研究進展[J]. 中國藥學雜志, 2011, 46(9):646-648.

[4] 田秀娟，盛敏佳，劉俊寶，等. 激素替代治療對絕經后女性心腦血管疾病的影響[J]. 中國老年學雜志, 2009, 29(18):2376-2377.

[5] Ferrari R, Agnoletti L, Comini L, et al. Oxidative stress during myocardial ischaemia and heart failure[J]. Eur Heart J, 1998, 19(Suppl B):B2-B11．

[6] Xin YF, Wana LL, Peng JL, et al. Alleviation of the acute doxorubicin-induced cardiotoxicity byLyciumbarbarumpolysaccharides through the suppression of oxidative stress[J]. Food Chem Toxicol, 2011, 49(1):259-264.

[7] Yong QC, Lee SW, Foo CS, et al. Endogenous hydrogen sulphide mediates the cardioprotection induced by ischemic postconditioning[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2008, 295(3):H1330-H1340．

[8] Nelson HD, Humphrey LL, Nygren P, et al. Postmeno-pausal hormone replacement therapy: scientific review[J]. JAMA, 2002, 288(7):872-881.

[9] Babiker FA, De Windt LJ, van Eickels M, et al. Estrogenic hormone action in the heart: regulatory network and function[J]. Cardiovasc Res, 2002, 53(3): 709-719.

[10]Yildirir A, Yarali H, Aybar F, et al. Hormone replace-ment therapy to improve left ventricular diastolic functionsin healthy postmenopausal women[J]. Int J Gynaecol Obstet, 2001, 75(3):273-278.

[11]Node K, Kitakaze M, Kosaka H, et al. Amelioration of ischemia- and reperfusion-induced myocardial injury by 17β-estradiol: role of nitric oxide and calcium-activized potassium channels[J]. Circulation, 1997, 96(6):1953-1963.

[12]Beer S, Reincke M, Kral M, et al. Susceptibility to car-diac ischemia/reperfusion injury is modulated by chronic estrogen status[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2002, 40(3):420-428.

[13]Pan TT, Feng ZN, Lee SW, et al. Endogenous hydrogen sulfide contributes to the cardioprotection by metabolic inhibition preconditioning in the rat ventricular myocytes[J]. J Mol Cell Cardiol, 2006, 40(1):119-130．

[14]Giordano FJ. Oxygen, oxidative stress, hypoxia, and heart failure[J]. J Clin Invest, 2005, 115(3):500-508．

[15]謝書陽，楊玲玲，陳 浩，等. Aβ和氧自由基誘導的培養神經元凋亡及維生素E的保護作用[J]. 中國老年學雜志, 2005, 25(4): 436-438.

[16]李政媛，張婷婷，陳宇豪，等. VE對去卵巢大鼠血清T-SOD、GSH-Px活力與心肌細胞凋亡的影響[J]. 吉林醫藥學院學報, 2009, 30(3):133-135.

[17]Matsui T, Tao J, del Monte F, et al. Akt activation preserves cardiac function and prevents injury after transient cardiac ischemiainvivo[J]. Circulation, 2001, 104(3):330-335．

[18]董 曦，孫桂波，羅 云，等．間充質干細胞條件培養基激活 Nrf2/ARE 通路對抗H2O2致H9c2細胞的氧化應激損傷[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(6):961-966．

[19]儲佳佳，李積東，雷 霖，等. 柚皮苷對高糖誘導的血管內皮細胞損傷及PI3K/Akt/eNOS信號通路的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(4):625-629.

(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

LBP regulates PI3K/Akt/eNOS signaling pathways in ovariectomized rat myocardium to exert antioxidative effect

YU Ning1, YANG Fang4, LENG Xue2,3, ZHANG Ni2,3, WANG Jun-yan2,3, SONG Nan2,3

(1TheFirstClinicalCollege,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,2KeyLaboratoryofMinistryofEducationforTCMViscera-StateTheoryandApplications,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,3TranslationalMedicineResearchCenterofTraditionalChineseMedicineinLiaoningProvince,4TheSecondAffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847,China.E-mail: 1135843243@qq.com)

AIM: To observe the influence ofLyciumbarbarumpolysaccharide (LBP) on the PI3K/Akt/eNOS signaling pathways in ovariectomized rat myocardium. METHODS: Female SD rats (n=30) were divided into sham operation group, ovariectomized group, progynova group, high-dose LBP group and low-dose LBP group. The serum levels of estradiol, lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK) were measured by ELISA. The myocardial contents of H2S and oxidative stress injury-related indicators were also detected. The morphological changes of the myocardium were observed with HE staining. The expression of eNOS and PI3K/Akt pathway-related proteins in the myocardium was determined by Western blot. RESULTS: Compared with sham operation group, the serum level of estradiol, the content of H2S, the activity of GSH-Px, and the expression of eNOS and PI3K/Akt pathway-related proteins in the myocardium in ovariectomized group were all decreased, and the levels of ROS and MDA in the myocardium were increased (P<0.05). The serum levels of LDH and CK were also increased. The arrangement of the myocardial cells was disordered, and the intercellular space was also increased in the ovariectomized group. Compared with ovariectomized group, the serum level of estradiol, the myocardial levels of H2S and GSH-Px, and the protein levels of eNOS and phosphorylated Akt were all increased in high dose group, while the levels of ROS and MDA in the myocardium were decreased (P<0.05). The serum levels of LDH and CK were also decreased. The morphological changes of the rat myocardium were improved in high dose group. CONCLUSION: LBP prevents and treats postmenopausal cardiovascular lesions through regulating PI3K/Akt/eNOS signaling pathways in ovariectomized rats.

Lyciumbarbarumpolysaccharides; Ovariectomized rats; Cardiovascular diseases; PI3K/Akt/eNOS signaling pathways

1000- 4718(2016)08- 1370- 06

2016- 01- 11

2016- 05- 24

遼寧中醫藥大學中醫臟象理論及應用教育部重點實驗室開放基金資助項目(No. F14-231-1-17)；遼寧中醫藥大學大學生創新創業訓練計劃(No. 201510162000002)

R285.5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.005

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 15104015589； E-mail: 1135843243@qq.com