全反式維甲酸增加胃癌細胞對放射的敏感性*

王艷萍， 趙先群， 張向東△， 許 威， 向曉輝

(1南陽市中心醫院消化科， 河南 南陽 473000； 2中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院肝膽胰脾疾病診療中心， 天津 300162)

·短篇論著·

全反式維甲酸增加胃癌細胞對放射的敏感性*

王艷萍1， 趙先群1， 張向東1△， 許 威2， 向曉輝2

(1南陽市中心醫院消化科， 河南 南陽 473000；2中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院肝膽胰脾疾病診療中心， 天津 300162)

目的： 研究全反式維甲酸(all-transretinoic acid，ATRA)對胃癌細胞SGC-7901存活率與放射敏感性的影響，并討論其可能的機制。方法: MTT法檢測細胞存活率；平板克隆形成實驗和流式細胞術分別檢測細胞的放射敏感性和細胞周期；實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞中Bax、Bcl-2、survivin與NF-κB的mRNA表達。結果: ATRA可降低SGC-7901細胞存活率，當濃度到達8 μmol/L時，抑制作用達到最大；ATRA聯合X射線處理后，與單純放射處理相比，平均致死劑量(D0)和準閾劑量(Dq)顯著變小(P<0.05)，且擬合的生存曲線明顯下移；ATRA能顯著降低放射誘導的細胞G2/M期阻滯，下調SGC-7901細胞Bcl-2與survivin的mRNA表達(P<0.05)，上調Bax與NF-κB的mRNA表達(P<0.05)。結論: ATRA能夠增加胃癌細胞SGC-7901的凋亡及放射敏感性，可能與抑制細胞周期G2/M期的阻滯作用、下調Bcl-2與survivin mRNA表達和上調NF-κB與Bax mRNA表達有關。

全反式維甲酸； 放射治療； 胃癌細胞SGC-7901； 敏感性

胃癌是常見來源于胃黏膜上皮細胞的消化道惡性腫瘤。胃癌在全球范圍內常見的惡性腫瘤中排第4位，死亡率占所有惡性腫瘤的第2位[1]。在中國，胃癌的發病率很高，僅次于肺癌與肝癌，其中男性發病率高于女性。臨床數據表明，中國的胃癌患者確診時大部分已進入III或IV期[2]，施行手術切除困難，獲得根治的比例很少，因此，在確診后進行放療化療是對胃癌進行綜合性治療的重要手段。然而，胃癌對放射治療敏感性低，可能是由于胃癌細胞對射線的敏感性低以及鄰近器官的耐受性低而致放射劑量受到限制，導致無法獲得理想的治療效果。

全反式維甲酸(all-transretinoic acid, ATRA)作為維生素A的主要代謝產物，主要參與調控細胞的增殖分化，具有誘導腫瘤細胞分化為成熟細胞或惡性逆轉，促進細胞凋亡，抗腫瘤血管生成，達到抑制腫瘤惡化的作用，是一種誘導分化劑[3-5]。全反式維甲酸對人胃癌BGC-823細胞的增殖具有抑制作用，與奧沙利鉑具有協同作用；其作用機制可能與Bcl-2和survivin蛋白下調有關[6]。全反式維甲酸作用于胃癌SGC-7901細胞72 h后，顯著抑制PPARγ的表達[7]。另外，全反式維甲酸通過下調survivin蛋白和增強caspase活性，誘導胃癌細胞MKN-45的凋亡[8]。對204例中晚期胃癌患者，采用全反式維甲酸聯合化療[9]，發現患者的近期療效好，生存期延長。但是，由全反式維甲酸引起的不良反應增加。本實驗擬用全反式維甲酸聯合放射治療對SGC-7901細胞的作用進行研究，并進一步探討其可能的作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃癌細胞株SGC-7901(江西省腫瘤醫院組織工程研究所)；胎牛血清和DMEM培養基(Gibco)，MTT試劑和全反式維甲酸(Sigma)；青霉素和鏈霉素(華北制藥股份有限公司)；碘化丙啶(propidium iodide，PI)(上海生工生物工程有限公司)； RNA提取試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)； Bax、Bcl-2、survivin與NF-κB引物設計與合成(上海生工生物工程有限公司)。

2 方法

2.1 細胞培養 將人胃癌細胞株SGC-7901置于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素與鏈霉素的DMEM培養液中，于37 ℃、5% CO2、99%飽和濕度的培養箱中培養，待細胞基本鋪滿瓶底時，用0.25%胰蛋白酶消化，換新鮮培養基，輕輕吹打至單細胞懸液，傳代，取對數生長期的細胞進行后續實驗。

2.2 MTT法檢測ATRA對SGC-7901細胞存活率的影響 收集處于對數增殖期的SGC-7901細胞，調整細胞為2×107/L，加于96孔板中，每孔100 μL，培養貼壁后，分別加入終濃度為1、2、4、8和16 μmol/L的ATRA，置于37 ℃、5% CO2、99%飽和濕度的培養箱中培養24 h，換100 μL新鮮培養基，加入20 μL MTT試劑(5 g/L)，繼續培養4 h，棄去MTT培養液，加入100 μL DMSO終止反應，于570 nm處采用酶聯免疫檢測儀(Bio-Rad)檢測吸光度(A)，細胞活力抑制率=(1-A藥物組)/A正常對照組×100%，設空白調零孔和正常對照組，每組6個復孔。

2.3 克隆形成實驗 收集處于對數生長期的SGC-7901細胞，消化制成單細胞懸液，待細胞貼壁，實驗分2組：放射(radidation，Rad)組：給予不同劑量X射線照射；聯合(combination，Com)組：8 μmol/L ATRA處理24 h，再給予不同劑量X射線照射。照射劑量分別為0、2、4、6和8 Gy，將細胞懸液稀釋為以下濃度：0 Gy組為每孔250個細胞；2 Gy組為每孔500個細胞，4 Gy組為每孔1 000個細胞，6 Gy組為每孔2 000個細胞和8 Gy組為每孔4 000個細胞。將培養板置于照射野(20 cm×20 cm)內，距射野邊緣為3 cm，用直線加速器6 MV的X線照射，源皮距(source-to-skin distance,SSD)為100 cm，劑量率為300 cGy/min。照射后，更換無藥培養液繼續培養14 d。用無水乙醇固定，結晶紫染色，顯微鏡下計數克隆數。細胞存活曲線依據靶單擊型模型公式SF=1-(1-e-D/D0)N擬合；克隆形成率(plating efficiency，PE)=克隆數/細胞數×100%；細胞存活分數(surviving fraction，SF)=照射劑量的克隆數/(細胞接種數×未照射克隆形成率)，并計算放射敏感性參數D0、Dq及N值。

2.4 流式細胞術檢測各組細胞的細胞周期 收集處于對數增殖期的SGC-7901細胞，實驗分4組：空白對照(control)組、ATRA組、6Gy組和ATRA+6Gy組，經相應處理后更換無藥培養液，置于37 ℃、5% CO2、99%飽和濕度的培養箱中培養24 h，0.25%胰蛋白酶消化后制備成單細胞懸液，加入PI染色，采用FC500流式細胞儀(Beckman Coulter)檢測細胞周期。

2.5 實時熒光定量PCR 依據2.4項分組，按照TRIzol說明書提取總RNA，反轉錄合成cDNA(引物序列見表1)，進行PCR擴增，擴增條件為95 ℃ 7 min；95 ℃ 15s、60 ℃ 60 s，40個循環；63 ℃ 5 min。所得結果于AB7500熒光定量操作系統(Life Technologies)進行分析，采用2-ΔΔCt法對結果進行計算。

3 統計學處理

采用SPSS 15.0統計軟件對所有實驗數據進行分析，實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間數據比較采用單因素方差分析，任意兩組數據間比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

表1 qPCR引物序列

結 果

1 ATRA對SGC-7901細胞存活率的影響

隨著ATRA濃度的升高，SGC-7901細胞的存活率逐漸下降；當ATRA濃度增加至8 μmol/L時，細胞存活率降至最低值(圖1)，后續實驗均采用8 μmol/L 的ATRA進行。

Figure 1. The inhibitory effect of ATRA at different concentrations on the viability of the SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1 不同濃度ATRA對SGC-7901細胞生長的抑制作用

2 平板克隆形成實驗測定SGC-7901細胞的放射敏感性

與放射組相比，在各照射劑量下聯合組的存活分數降低，并有生存曲線的整體下移，見圖2、表2。

Figure 2.The effect of ATRA on the radiosensitivity of SGC-7901 cells. Com: combination (ATRA+X-ray radiotherapy); Rad: X-ray radiotherapy alone. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRad group.

圖2 ATRA對SGC-7901細胞放射敏感性的影響

表2 SGC-7901細胞照射后存活曲線的相關參數

Com: combination (ATRA+X-ray radiotherapy); Rad: X-ray radiotherapy alone.*P<0.05vsRad group.

3 各組SGC-7901細胞周期的變化

與對照組相比，ATRA組、6 Gy組和ATRA+6 Gy組的細胞周期G2/M期的比例顯著增加(P<0.05)，6 Gy組中G2/M期的所占比例最大，其中ATRA+6 Gy組G2/M期的所占比例顯著低于6 Gy組(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The change of cell cycle in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs6 Gy group.

圖3 各組SGC-7901細胞周期的變化

4 SGC-7901細胞中Bax、Bcl-2、survivin與NF-κB mRNA表達的變化

與對照組相比，ATRA組、6 Gy組和ATRA+6 Gy組Bcl-2與survivin的mRNA表達顯著下降(P<0.05)，Bax與NF-κB的mRNA表達顯著上升(P<0.05)；其中ATRA+6 Gy組的變化幅度顯著大于ATRA組和6 Gy組，見圖4。

討 論

放射治療是一種局部或區域治療的手段，臨床適應范圍更廣，對于晚期患者選擇合理的放療可獲得良好的姑息性治療效果。但由于臨床胃癌晚期患者放療的治療效果差，復發率高，并出現遠處轉移，為了提高放療的療效，提高腫瘤細胞對射線的敏感性具有非常重要的意義。為此，本實驗對全反式維甲酸胃癌細胞SGC-7901的放射敏感性及其相關機制進行了初步研究。

隨著全反式維甲酸濃度增加，對胃癌細胞SGC-7901的生長抑制作用越顯著，并與8 μmol/L時達到最大值。克隆形成實驗結果表明，聯合組的D0、Dq及N值均低于單純照射組，且其存活曲線整體下移。提示，聯合細胞的亞致死損傷修復能力降低，全反式維甲酸在一定程度上提高了細胞的放射敏感性。大量研究數據表明，細胞的放射敏感性隨細胞周期時相的變化而改變。腫瘤細胞進入G2期與M期時，放射敏感性會增高。當腫瘤細胞受到射線照射引起DNA損傷后，細胞周期會出現阻滯于G1/S期或G2/M期，進行DNA損傷的修復[10]，未能成功修復則啟動凋亡信號使細胞產生凋亡[11]。同時給予全反式維甲酸與放射處理后，SGC-7901細胞的G2/M期阻滯時間相對于給予單純放射時縮短，推測全反式維甲酸破壞腫瘤細胞DNA損傷修復過程，導致腫瘤細胞凋亡增加，從而增加腫瘤細胞的放射敏感性。

Figure 4.The mRNA expression of Bax, Bcl-2, survivin and NF-κB in the SGC-7901 cells with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 SGC-7901細胞中Bax、Bcl-2、survivin與NF-κB的mRNA表達

NF-κB是腫瘤細胞中廣泛表達的轉錄因子，普遍認為腫瘤細胞的放射抵抗性與NF-κB的激活有關，激活NF-κB可以增強腫瘤細胞的放射敏感性，特定條件下發揮促凋亡作用[12]。給予全反式維甲酸聯合放射處理后，SGC-7901細胞中NF-κB的mRNA表達顯著上升，提示全反式維甲酸增加SGC-7901細胞的放射敏感性可能與NF-κB的激活有關。Survivin是凋亡抑制蛋白的成員之一，具有調控細胞周期，促進血管生成的作用，與腫瘤細胞的放射敏感性有密切關系[13]。NF-κB上調抗凋亡蛋白Bcl-2，進一步下調IκBα的表達，從而增強NF-κB的活化，形成一個正反饋循環。Bcl-2與Bax是一對凋亡調控相關蛋白，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白。研究發現，當給予全反式維甲酸聯合放射處理后， Bcl-2與survivin的mRNA表達明顯下降，Bax的mRNA表達明顯上升。綜上所述，全反式維甲酸具有提高胃癌細胞SGC-7901的放射敏感性，并促進腫瘤細胞的凋亡，其作用機制可能與下調Bcl-2與survivin mRNA表達以及上調NF-κB與Bax mRNA表達有關。

本文首次采用全反式維甲酸聯合X射線治療，對胃癌細胞的放射敏感性進行研究。與傳統單獨采用放射治療相比，發現全反式維甲酸確實能提高放射治療的療效。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of all-transretinoic acid on sensitivity of gastric cancer cells to radiotherapy

WANG Yan-ping1, ZHAO Xian-qun1, ZHANG Xiang-dong1, XU Wei2, XIANG Xiao-hui2

(1DepartmentofGastroenterology,NanyangCentralHospital,Nanyang473000,China;2CenterofHepatobiliary,Pan-creaticandSplenicDiseases,AffiliatedHospitalofLogisticalCollege,CPLA,Tianjin300162,China.E-mail:docnany@126.com)

AIM: To investigate the effect of all-transretinoic acid (ATRA) on the viability of gastric cancer cell SGC-7901 and the sensitivity to radiotherapy. METHODS: MTT assay was used to examine the cell viability. Radio-sensitivity and cell cycle were determined by colony formation assay and flow cytometry, respectively. The mRNA levels of Bax, Bcl-2, survivin and NF-κB in the cells were measured by RT-qPCR. RESULTS: ATRA inhibited the viability of SGC-7901 cells in a concentration-dependent manner. The maximal inhibition was at concentration of 8 μmol/L. Colony formation assay revealed that the combination of ATRA with X-ray treatment significantly reduced the values of D0 and Dq, and shifted down the fitting survival curve, as compared with radiotherapy alone. Moreover, ATAR markedly decreased the percentage of G2/M phase in the SGC-7901 cells (P<0.05). In addition, following ATRA treatment, the mRNA levels of Bcl-2 and survivin were decreased (P<0.05), whereas the mRNA levels of Bax and NF-κB were increased (P<0.05). CONCLUSION: ATRA enhances the sensitivity of SGC-7901 cells to radiotherapy, inhibits G2/M arrest and regulates the mRNA expression of Bax, Bcl-2, survivin and NF-κB.

All-transretinoic acid; Radiotherapy; Gastric cancer cell SGC-7901; Sensitivity

1000- 4718(2016)08- 1440- 05

2016- 04- 07

2016- 06- 28

國家自然科學基金青年項目(No. 81500489)

R811.5; R735.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.017

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