芪參益氣滴丸對(duì)正常家兔血小板胞漿內(nèi)游離鈣濃度的影響

宋郁珍，史俊玲，杜鴻瑤，李　琳，羅冬輝

1.河北省唐山市中醫(yī)醫(yī)院(河北唐山063000)，E-mail：3321407431@qq.com；2.河北省唐山市遷西縣人民醫(yī)院

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芪參益氣滴丸對(duì)正常家兔血小板胞漿內(nèi)游離鈣濃度的影響

宋郁珍1，史俊玲1，杜鴻瑤1，李琳1，羅冬輝2

1.河北省唐山市中醫(yī)醫(yī)院(河北唐山063000)，E-mail：3321407431@qq.com；2.河北省唐山市遷西縣人民醫(yī)院

摘要：目的研究芪參益氣滴丸對(duì)正常家兔血小板胞漿游離鈣濃度[Ca2+]i 的影響。方法以Fura - 2/AM熒光分光光度法測定家兔血小板內(nèi)[Ca2+]i 的變化。結(jié)果對(duì)照組的血小板[Ca2+]i為(217.020 4±94.399 4)nmol/L，芪參益氣滴丸小劑量組血小板[Ca2+]i為(197.152 5±89.574 3)nmol/ L，中劑量組為(120.680 2±71.452 6)nmol/ L，大劑量組為(84.849 0±26.335 9)nmol/ L。與對(duì)照組相比，芪參益氣滴丸不同劑量組均能夠降低正常大鼠血小板[Ca2+]i。不同劑量的芪參益氣滴丸與血小板[Ca2+]i之間呈線性相關(guān)。結(jié)論推測芪參益氣滴丸的益氣活血通脈作用可能與其降低血小板內(nèi)[Ca2+]i相關(guān)。

關(guān)鍵詞：芪參益氣滴丸；血小板；鈣離子；益氣通脈；活血止痛

芪參益氣滴丸是治療氣虛血瘀型胸痹心痛的中成藥，由黃芪、丹參、三七、降香藥物組成，具有益氣通脈、活血止痛之功效。前期的藥效結(jié)果表明，芪參益氣滴丸具有抗心肌缺血、抗血栓形成、降低血小板聚集與黏附、降血脂和抑制動(dòng)脈斑塊形成的作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀察芪參益氣滴丸對(duì)血小板內(nèi)游離鈣離子濃度[Ca2+]i的影響，探討芪參益氣滴丸益氣通脈、活血止痛作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物家兔體重2.2 kg～2.5 kg，由北京芳緣園養(yǎng)殖場提供。

1.2藥品與試劑芪參益氣滴丸浸膏為天士力藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)前用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配置成每毫升2 g、4 g、8 g生藥，供家兔灌胃給藥用。Fura-2/AM為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，貨號(hào)：S1052。二甲基亞砜(DMSO)由天津市化學(xué)試劑三廠提供，批號(hào)：20080628。Fura-2/AM用二甲亞砜(DMSO) 溶解成1 mmol/L，分裝密封后置-20 ℃避光保存。RPMI 1640 為Gibco 公司產(chǎn)品，4 ℃保存。牛血清白蛋白(BSA)為聯(lián)星生物制品科技有限公司產(chǎn)品。Hepes為寶泰克生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)：Sigma0603。新鮮配制的3.8%枸櫞酸鈉溶液(ACD，檸檬酸鈉89 mmol/L，檸檬酸16 mmol/L，葡萄糖243 mmol/L)，枸櫞酸鈉為天津市津北津細(xì)化工有限公司提供，批號(hào)：20080717。TritonX-100為天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供，批號(hào)：20080828。 乙二醇雙四乙酸(EGTA)為上海潤捷化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：20081008。

1.3儀器本實(shí)驗(yàn)儀器由天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心提供：CO2恒溫培養(yǎng)箱FORMA3111型：Thermo公司產(chǎn)品。倒置顯微鏡LeicaDMIL型：Leica公司產(chǎn)品。多功能讀板機(jī)Flex Station 3型：Molecular Devices公司產(chǎn)品。

1.4方法

1.4.1分組及給藥實(shí)驗(yàn)將家兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組及芪參益氣滴丸高、中、低劑量組。芪參益氣滴丸高、中、低劑量組分別給以芪參益氣滴丸2 g生藥/kg、4 g生藥/kg、8 g生藥/kg。給藥量為1 mL/kg，每日1次，連續(xù)給藥4周。

1.4.2血小板懸液的制備家兔清醒狀態(tài)下利多卡因頸部局麻后，頸動(dòng)脈插管采血。用新鮮配制的3.8%枸櫞酸鈉溶液，以1∶9 (ACD∶血) 的比例抗凝。以1 000 r/ min 離心10 min制備富血小板血漿(platetlet-rich plasma，PRP)，再將PRP以3 000 r/min離心5 min分離得血小板，用RPMI1640 溶液5 mL(不含BSA，pH 7.40) 洗滌血小板1次， 進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，用0.4%臺(tái)酚藍(lán)檢測細(xì)胞存活率，要求細(xì)胞數(shù)多于1×109/L，細(xì)胞存活率90%以上[1]。

1.4.3Fura-2/AM負(fù)載和熒光測定[2]將負(fù)載液(為RPMI1640培養(yǎng)液含有2 g/L BSA 和10 mmol/L Hepes，pH7.40)稀釋的血小板懸液分為A、B兩管。A管加入Fura-2/AM(終濃度為2.5 μmol/L)，B管加入等量的DMSO溶液，均在37 ℃孵箱內(nèi)孵育60 min。孵育后3 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用無Ca2+Tyrode 緩沖液(NaCl 140 mmol/L，KCl 3 mmol/L，MgSO41 mmol/L，Hepes 10 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，pH 7.40) 洗滌，離心2次后懸浮于2 mL的無Ca2+Tyrode 緩沖液中，充分混勻后進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定(Exλ1∶350 nm，Exλ2∶380 nm，Emλ1∶490 nm，Ex和Em光柵10 nm)。計(jì)算血小板[Ca2+]i水平前，先減去未加Fura-2/AM 負(fù)載的自發(fā)熒光，即R = F350/ F380 =(A管F350-B 管F350)/(A 管F380-B 管F380)。計(jì)算出R 值后，再用公式[2]即[Ca2+]i = KD[(R-R2 min)/(Rmax-R)](sf2/sb2) 計(jì)算血小板[Ca2+]i。用線性回歸法檢測芪參益氣滴丸不同濃度對(duì)血小板[Ca2+]i 值變化的量效相關(guān)性。

2結(jié)果

與對(duì)照組相比，芪參益氣滴丸不同劑量組均能夠降低正常大鼠血小板[Ca2+]i。不同劑量的芪參益氣滴丸與血小板[Ca2+]i之間呈線性相關(guān)。詳見表1。

表1　芪參益氣滴丸對(duì)正常家兔血小板

3討論

冠心病中醫(yī)證候研究近年來主要集中在心氣虛證和心血瘀證。芪參益氣滴丸以益氣活血通脈為治療原則，現(xiàn)廣泛用于冠心病、心衰、心肌炎的治療。其中黃芪味甘、性微溫，為君藥，《本經(jīng)》載黃芪為補(bǔ)藥之長“氣為血帥，氣充則血行”，因此通過補(bǔ)氣以化血瘀，補(bǔ)益心氣，填補(bǔ)胸中宗氣，以助心陽，同時(shí)助后天之本的運(yùn)化，以滋氣血生化之源，且黃芪味輕，補(bǔ)而不滯，使氣旺而促血行。以丹參、三七為臣藥，取其活血祛瘀之功用，丹參與三七配伍，一溫一涼，涼血不留瘀，活血而不傷氣，共為臣藥，與補(bǔ)氣藥黃芪相須為用，益氣化瘀，疏通脈道，能起到活血化瘀通脈的作用。以降香為佐使，取其行氣活血、止痛之功效，降香性溫，在本方中其芳香辛竄、溫通行滯而達(dá)散瘀止痛之效。諸藥同用，攻補(bǔ)兼施、標(biāo)本兼顧、通補(bǔ)結(jié)合，共奏益氣、活血、通脈止痛之功，使心氣旺盛，心脈通暢，從而有效地緩解臨床癥狀，改善心肌缺血、缺氧等。

芪參益氣滴丸益氣活血通脈抗凝作用機(jī)制很復(fù)雜，其中抗血小板聚集作用和對(duì)血小板胞漿內(nèi)游離鈣濃度[Ca2+]i的影響可能是關(guān)鍵性作用。血小板[Ca2+]i是血小板代謝與功能的一個(gè)重要因子。它的增高可觸發(fā)血小板的變形、聚集、釋放反應(yīng)。血小板[Ca2+]i增高可激活肌球蛋白輕鏈酶，促進(jìn)包括磷酸酯酶A2等多種Ca2+依賴性蛋白酶的作用，從而改變血小板的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，使血栓烷A2(TXA2) 的生成增加及血小板釋放反應(yīng)增強(qiáng)。因此，血小板[Ca2+]i增高是血小板參與血栓形成的重要機(jī)制之一，血小板[Ca2+]i的升降可反映血小板的功能變化[3]。以往實(shí)驗(yàn)研究表明， 黃芪可以減少血小板的黏附率，有減輕鈣超載抗脂質(zhì)過氧化作用從而保護(hù)血管內(nèi)皮功能并能改善心肌代謝增加抗缺氧能力穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜功能[4-7]。丹參對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用及對(duì)炎癥反應(yīng)有抑制作用，還能抑制血小板，降低血液黏滯性使血流加速[8]。丹參水溶性成分如丹參素、迷迭香酸均具有不同程度的抑制血小板聚集功能，有明顯的抗凝作用[9，10 ]。三七主要成分三七皂苷可能通過提高血小板環(huán)磷腺苷(cAMP)含量、減少血栓素A2的生成而抑制其聚集功能[11]。三七皂甙是三七治療缺血性心臟病的基礎(chǔ)[12]，其機(jī)制可能與其非選擇性鈣拮抗作用和抗氧化作用有關(guān)。降香[13]對(duì)前列腺素有強(qiáng)烈的抑制作用，抑制由二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量芪參益氣滴丸均能明顯降低正常大鼠血小板[Ca2+]i，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且呈劑量依賴性，提示芪參益氣滴丸的益氣活血通脈的作用可能與抑制血小板胞漿內(nèi)游離鈣濃度有關(guān)。已知血小板[Ca2+]i的降低能抑制血小板活性和血小板聚集，減少血栓形成，因而芪參益氣滴丸能在防治存在高黏滯狀態(tài)的冠心病和心衰等疾病中產(chǎn)生良好的活血化瘀作用。

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(本文編輯郭懷印)

(收稿日期：2015-08-19)

中圖分類號(hào)：R329R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．06．010

文章編號(hào)：1672-1349(2016)06-0592-03

基金項(xiàng)目：河北省中醫(yī)藥管理局課題(No.2014268)

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