阿托伐他汀對潰瘍性結腸炎小鼠炎癥因子和血管內皮的影響

張艷麗，陳還珍，劉　帥，劉子源，魏　霞

1.山西醫科大學第一臨床醫學院(太原 030001)；2.山西醫科大學第一醫院

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阿托伐他汀對潰瘍性結腸炎小鼠炎癥因子和血管內皮的影響

張艷麗1，陳還珍2，劉帥1，劉子源1，魏霞1

1.山西醫科大學第一臨床醫學院(太原 030001)；2.山西醫科大學第一醫院

摘要：目的觀察阿托伐他汀對潰瘍性結腸炎小鼠炎癥因子表達水平的影響。方法 將27只清潔級C57BL/6小鼠隨機分成3組，模型組和干預組飲用2%葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶液，干預組在造模前1周給予阿托伐他汀灌胃，持續42 d至實驗結束。比較各組小鼠的一般情況和結腸組織病理學，ELISA法檢測血清白介素-8(IL-8)和血管內皮生長因子(VEGF)的水平，免疫組化法檢測主動脈核轉錄因子(NF-κB)和VEGF的表達。 結果與對照組相比，模型組小鼠腸道黏膜的炎癥表現明顯，血清IL-8和VEGF的水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，干預組血清IL-8和VEGF的水平顯著降低(P<0.05)，免疫組化法提示小鼠主動脈NF-κB和VEGF的表達減少(P<0.05)。 結論 阿托伐他汀可能通過降低炎癥因子的表達水平而發揮血管內皮的保護作用。

關鍵詞：潰瘍性結腸炎；阿托伐他汀；白介素-8；血管內皮生長因子；核轉錄因子

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是以腸道炎癥為主要表現的慢性復發性自身免疫性疾病，屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的范疇，引起腸道炎癥持續存在的重要原因和特征是黏膜組織中炎細胞聚集和釋放各種炎癥因子。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是血管壁的慢性炎性疾病，機體慢性持續性炎癥狀態與動脈粥樣硬化的形成密切相關。研究發現炎癥性腸病病人患動脈粥樣硬化的風險增加[1]，并提出持久的或活動的IBD可能是早期動脈粥樣硬化的危險因素。阿托伐他汀是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，除了調脂和穩定斑塊的作用，還有抗炎、抗氧化及免疫調節等作用[2-3]。本研究通過觀察阿托伐他汀對潰瘍性結腸炎小鼠炎癥因子表達水平的影響，探討其是否通過降低炎癥因子的表達水平而發揮保護血管內皮的作用。

1材料與方法

1.1動物8周齡，體重20 g±2 g，清潔級C57BL/6小鼠27只，雄性，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。

1.2主要試劑葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)分子量36 000～50 000，購自MP Biomedicals；白介素-8(IL-8)和血管內皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒購自Bio-Swamp Life Science；核轉錄因子(NF-κB)-p65多克隆抗體和VEGF-A多克隆抗體購自Bioworld Technology；免疫組化Ⅱ抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1潰瘍性結腸炎小鼠模型的建立及分組27只雄性清潔級C57BL/6小鼠普通飼養1周后，隨機分成3組，每組9只。對照組：正常飲用滅菌蒸餾水。模型組：自由飲用2%DSS溶液1周，停止飲用DSS溶液改用滅菌蒸餾水1周，如此循環2.5次，并給予等體積生理鹽水灌胃。干預組：建模的小鼠提前1周給予阿托伐他汀混懸液10 mg/(kg·d)灌胃，每天1次，持續42 d至實驗結束。實驗過程中，每3 d稱重1次，觀察記錄小鼠血便、稀便、腹瀉等腸炎表現。

1.3.2取材給予腹腔注射水合氯醛麻醉后眼眶采血，采血結束后用脫頸法處死小鼠，游離主動脈、結腸和直腸，切取主動脈和肛門至回盲部的整個結直腸段，用生理鹽水將主動脈和腸管沖洗干凈并將標本分為幾段，一部分迅速放入10%中性甲醛中，用于HE染色和免疫組化染色；另一部分迅速置于液氮中，過夜后于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3HE染色將標本置于甲醛中固定24 h～48 h，經石蠟包埋、切片、常規脫蠟、HE染色及脫水封片后，比較小鼠腸管病理學改變。

1.3.4ELISA法測定血清IL-8和VEGF將血液置于肝素化的EP 管中，靜置后離心(3 500 r/min、10 min)，取血清于-20 ℃冰箱保存，實驗結束后，按照試劑盒說明書測定IL-8和VEGF濃度。

1.3.5免疫組化法檢測主動脈NF-κB和VEGF標本經甲醛固定、石蠟包埋及切片等，免疫組化操作過程采用SABC法，加入1抗(兔抗鼠NF-κB濃度1∶200、兔抗鼠VEGF濃度1∶200) 和生物素化山羊抗兔IgG，經DAB顯色、蘇木素復染等，在顯微鏡下獲取圖片并分析數據。

2結果

2.1一般情況整個實驗期間，對照組小鼠反應靈敏、毛色有光澤，糞便呈暗褐色、質地較硬，體重均有不同程度的增加；模型組小鼠反應遲緩、倦怠懶動、食欲減退，稀便或血便，體重均有不同程度的下降，阿托伐他汀干預后小鼠上述表現明顯好轉。

2.2結腸組織病理損害鏡下可見對照組小鼠結腸組織結構完整，黏膜無充血、水腫及炎細胞浸潤；模型組小鼠結腸組織炎癥明顯，黏膜充血水腫、糜爛，甚至典型潰瘍形成，伴炎細胞浸潤，腺體排列紊亂甚至消失；干預組腸道炎癥較模型組明顯減輕，黏膜和腺體逐漸被修復，黏膜充血水腫、糜爛好轉。詳見圖1。

對照組模型組干預組

圖1各組小鼠結腸組織HE染色結果(×40 倍)

2.3血清IL-8和VEGF的水平比較與對照組相比，模型組小鼠血清IL-8和VEGF的水平顯著升高；與模型組相比，干預組血清IL-8和VEGF的水平顯著降低。3組間血清IL-8和VEGF比較差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1　各組血清IL-8、VEGF水平比較(±s) 　pg/mL

2.4主動脈NF-κB和VEGF的水平比較與對照組相比，模型組和干預組小鼠主動脈NF-κB和VEGF表達增加(P<0.05)，主要見于血管內皮細胞(鏡下可見活化的NF-κB主要位于細胞核；VEGF染色主要位于細胞質)，呈棕褐色；與模型組相比，干預組小鼠主動脈NF-κB和VEGF表達減少(P<0.05)。詳見表2。

表2　各組主動脈NF-κB、VEGF OD值比較(±s)

3討論

潰瘍性結腸炎的病因和發病機制尚未明確，研究發現，細胞因子在UC腸黏膜免疫反應中發揮著重要作用。Ross于1999年在損傷反應學說的基礎上，提出動脈粥樣硬化是一種炎性疾病，具有慢性炎癥特征的病理過程，其發生發展始終伴隨著炎癥反應。研究評估了IBD病人動脈粥樣硬化的預測因素，發現IBD存在早期動脈粥樣硬化[4]。研究認為IL-8在UC發病過程中不可缺少，能激活并趨化中性粒細胞，釋放一系列活性產物，引起機體局部炎癥反應。潰瘍性結腸炎病人腸黏膜高表達NF-κB-p65，且IL-8表達水平升高與NF-κB呈正相關[5]。他汀類除了調脂和穩定斑塊的作用，還有抗炎、抗氧化及免疫調節等作用。本實驗發現，模型組小鼠血清IL-8水平顯著升高，阿托伐他汀干預后結腸炎癥明顯減輕，血清IL-8顯著降低，表明阿托伐他汀可降低UC小鼠炎癥因子的表達。

NF-κB信號通路是主要的炎癥通路之一，其異常激活與AS的發生發展密切相關[6]。研究顯示活化的NF-κB存在于人類動脈粥樣硬化斑塊上。AS小鼠主動脈NF-κB mRNA表達顯著增加，抗AS藥物可降低NF-κB表達[7]。本實驗中模型組小鼠主動脈NF-κB表達增加，阿托伐他汀干預后小鼠NF-κB表達減少，與上述研究結果一致。

VEGF可通過炎癥浸潤和新生血管形成等機制促進AS的形成[8]。正常生理條件下，VEGF呈低表達或不表達，但氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、炎癥因子等動脈粥樣硬化危險因素可促進VEGF的表達，研究表明，人冠狀動脈粥樣斑塊標本中VEGF高度表達，急性冠脈綜合征病人血清VEGF水平也顯著升高[9]。Wilson等[10]證實，他汀類可減少VEGF的表達，減少新生血管形成。本實驗發現，模型組小鼠血清和主動脈VEGF的水平顯著升高，阿托伐他汀干預后小鼠血清和主動脈VEGF表達降低。

他汀可抑制NF-κB的轉錄活性和DNA結合活性，通過抑制基因的表達和NF-κB的信號傳導而具有免疫調節和抗炎的作用[11]。他汀類藥物的抗炎機制可能與降低炎癥因子的表達、減少炎細胞的黏附和聚集、抑制平滑肌細胞的增生和遷移有關。本實驗發現，模型組小鼠炎癥因子表達水平升高，阿托伐他汀干預后血清IL-8水平顯著下降，且干預組小鼠主動脈NF-κB和VEGF表達降低，表明阿托伐他汀可能通過抑制NF-κB轉錄活性，降低炎癥因子的水平，進而干預炎癥反應，減少VEGF的表達而發揮血管內皮的保護作用。阿托伐他汀因其多效性可能具有潛在的控制潰瘍性結腸炎和防治冠狀動脈疾病的雙重作用，關于潰瘍性結腸炎早期動脈粥樣硬化的發病機制及有效的防治策略需要更多大型的臨床研究和動物實驗加以證實。

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(本文編輯郭懷印)

(收稿日期：2015-10-25)

中圖分類號：R573.1R259

文獻標識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．06．012

文章編號：1672-1349(2016)06-0597-03

通訊作者：陳還珍，E-mail：276085726@qq.com