烏司他丁注射液對急性肺損傷循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞血管生成能力的影響

羅幫鎮(zhèn)，謝南姿，劉　陽，王海峰，謝曉云

同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院(上海 200065)

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烏司他丁注射液對急性肺損傷循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞血管生成能力的影響

羅幫鎮(zhèn)，謝南姿，劉陽，王海峰，謝曉云

同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院(上海 200065)

摘要：目的觀察烏司他丁注射液對急性肺損傷循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞血管生成能力的影響。方法成年新西蘭大耳白兔(2.5 kg～3.0 kg)共40只隨機(jī)分為3組，正常對照組、急性肺損傷組、急性肺損傷組+烏司他丁治療組分別采用免疫組化法觀察肺毛細(xì)血管密度，病理評價(jià)肺泡炎癥。檢測體外內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管能力。結(jié)果HE染色評估肺泡炎癥發(fā)現(xiàn)急性肺損傷與烏司他丁治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；免疫組化觀察到烏司他丁治療組肺毛細(xì)血管密度較正常對照組、急性肺損傷組增加(P<0.05)；在體外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)同樣發(fā)現(xiàn)烏司他丁治療組內(nèi)皮祖細(xì)胞的成血管能力較正常對照組、急性肺損傷組提高(P<0.05)。結(jié)論烏司他丁注射液能提高急性肺損傷循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管能力。

關(guān)鍵詞：急性肺損傷；內(nèi)皮祖細(xì)胞；烏司他丁注射液；成血管能力

急性肺損傷時(shí)內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)參與到肺泡-毛細(xì)血管的修復(fù)，2008年內(nèi)皮祖細(xì)胞移植至油酸誘導(dǎo)的急性肺損傷兔模型[1]的研究已證實(shí)，在急性肺損時(shí)內(nèi)皮祖細(xì)胞可歸巢到肺毛細(xì)血管，起到修復(fù)肺損傷的作用，在最近的研究中也有類似的研究。2013年在Chest[2]發(fā)表的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用內(nèi)皮祖細(xì)胞或單獨(dú)使用辛伐他丁均能減輕急性肺損傷，如聯(lián)合治療效果更好，研究沒有更深入討論機(jī)制研究，實(shí)驗(yàn)提示內(nèi)皮祖細(xì)胞可進(jìn)行急性肺損傷修復(fù)，并且利用藥物提高內(nèi)皮祖細(xì)胞功能是研究的一個(gè)重要手段及研究熱點(diǎn)。烏司他丁注射液(ulinastatin injection，UTI)具備了治療急性肺損傷的潛力。烏司他丁是從健康尿液中提取的蛋白酶抑制劑，可有效地減輕炎癥滲出及炎癥因子的釋放[3]，也有研究證明它有利于內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)及維持動(dòng)脈內(nèi)膜完整，現(xiàn)主要的研究偏向于烏司他丁減輕炎癥因子或中性粒細(xì)胞從而減低內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，但暫未見烏司他丁和內(nèi)皮祖細(xì)胞的研究。為此，本研究主要針對烏司他丁是否提高內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管能力展開。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年新西蘭大耳白兔(2.5 kg～3.0 kg)共40只，購自廣東省動(dòng)物中心，根據(jù)國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康使用規(guī)范指南飼養(yǎng)，所有操作符合廣東省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的要求。

1.2材料與試劑M199培養(yǎng)液、胎牛血清購自Hyclone 公司；人淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊镏破酚邢薰荆惑w外血管形成試劑盒、DIL-labeled acetylated LDL(Dil-acLDL)、FITC標(biāo)記荊豆凝集素Ⅰ(FITCUEA-1)、oleicacid(75 mg/kg)均購自Sigma公司。VWF抗體(博奧森)；ChemMate TM DAKO Envision TM Detection Kit (DAKO)，烏司他丁注射液(天普洛安)。PKB阻斷劑(LY-294002)；eNOS阻斷劑(L-NAME)。

1.3方法

1.3.1分組肺毛細(xì)血管密度分3組：正常對照組、急性肺損傷組、烏司他丁治療組。正常對照組：正常新西蘭大耳兔，體重(2.0±0.5)kg，均為雄性，共10只，進(jìn)行免疫組化觀察肺毛細(xì)血管密度；病理評價(jià)肺泡炎癥。急性肺損傷兔組：正常新西蘭大耳兔，體重(2.0±0.5)kg，均為雄性，共10只。造模成功24 h進(jìn)行分別進(jìn)行免疫組化觀察肺毛細(xì)血管密度；病理評價(jià)肺泡炎。烏司他丁治療組：正常新西蘭大耳兔，體重(2.0±0.5)kg，均為雄性，共10只，造模成功后使用40 000 U/(kg·d)烏司他丁治療48 h后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分別進(jìn)行免疫組化觀察肺毛細(xì)血管密度；病理評價(jià)肺泡炎癥。

體外內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管能力檢測分為3組：正常對照組、急性肺損傷組、烏司他丁治療組。正常對照組：正常新西蘭大耳兔，體重(2.0±0.5)kg，均為雄性，共6只，抽取10 mL外周血分離誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞7 d后，行內(nèi)皮祖細(xì)胞鑒定。48 h后，檢測成血管能力測定。急性肺損傷組：正常新西蘭大耳兔，體重(2.0±0.5)kg，均為雄性，共6只，造模成功24 h后，抽取10 mL外周血，分離誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞。48 h后，檢測成血管能力測定。烏司他丁治療組：正常新西蘭大耳兔，體重(2.0±0.5)kg，均為雄性，共6只，造模成功24 h后，抽取10 mL外周血，分離誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞。內(nèi)皮祖細(xì)胞加入1 000 U/mL烏司他丁培養(yǎng)48 h后，檢測成血管能力測定。

1.3.2EPCs的分離培養(yǎng)肝素抗凝取骨髓10 mL，采用密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，接種在24孔板上。應(yīng)用M199培養(yǎng)基(含20%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL)培養(yǎng)，用PBS洗去非貼壁細(xì)胞。換培養(yǎng)液后培養(yǎng)至7 d，PBS液去除非貼壁細(xì)胞，對貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.3.3EPCs的鑒定按2×106～3×106接種在纖連蛋白包被24孔板，細(xì)胞爬片培養(yǎng)第4天取出，將細(xì)胞與2.4 ng/mL的DIL-acLDL在37 ℃溫度下孵育1 h，以檢測EPCs攝取DIL-acLDL。采用2%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min。應(yīng)用PBS清洗2 min，10 ng/mL的FITC-UEA-1加于上述標(biāo)本，37 ℃溫度下孵育1 h。采用激光共聚焦顯微鏡鑒定DIL-acLDL和FITC-UEA-1雙染色陽性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞。

1.3.4病理切片評估肺泡炎癥部分左肺組織經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色后用普通光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)變化。根據(jù)肺泡炎癥的特點(diǎn)炎癥細(xì)胞滲出，肺泡間隔增大，根據(jù)受損面積肺泡炎癥分級：0級，無肺泡炎；Ⅰ級，輕度肺泡炎，少于20%的肺病灶區(qū)；Ⅱ級，中度肺泡炎，病變區(qū)20%～50%；Ⅲ級，彌漫 病變面積大于50%。

1.3.5EPCs血管生成能力檢測采用體外血管生成試劑盒檢測體外EPCs的血管生成能力。200倍倒置顯微鏡下觀察小血管生成情況。細(xì)胞拉長變形，長度為寬度的4倍以上即可被認(rèn)為形成小管。選擇200倍光鏡下5個(gè)視野，計(jì)數(shù)小管數(shù)。

1.3.6免疫組化評估肺毛細(xì)血管密度血管性血友病因子(von willebrand factor VWF)是內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，經(jīng)常被用于病理切片上確定毛細(xì)血管數(shù)目，按免疫組化試劑盒步驟，應(yīng)用免疫組化圖像自動(dòng)分析模塊，計(jì)算陽性目標(biāo)總面積/統(tǒng)計(jì)場總面積，即每平方毫米的毛細(xì)血管密度。

1.3.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，體外成血管能力檢測、肺毛細(xì)血管密度方差分析，肺泡炎癥評估采用秩和檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1肺部HE染色急性肺損傷見肺部嚴(yán)重滲出，經(jīng)烏司他丁治療后滲出較急性肺損傷組減少。根據(jù)受損面積肺泡炎癥分級，急性肺損傷組與烏司他丁治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1　急性肺損傷組及烏司他丁治療組肺泡炎癥評估 　只

2.2肺毛細(xì)血管密度棕色染色為血管性血友病因子抗體陽性，肺毛細(xì)血管密度比較烏司他丁治療組較急性肺損傷組明顯增加(P<0.05)。詳見表2。

表2　3組血管密度比較(±s)

2.3內(nèi)皮祖細(xì)胞鑒定共聚焦顯微鏡觀察EPCs攝取熒光雙染陽性： DiL-acLDL染色細(xì)胞呈紅色；FITC-UEA-I染色細(xì)胞呈綠色；雙染色細(xì)胞同時(shí)呈紅、綠色。通過共聚焦顯微鏡鑒定，F(xiàn)ITC-UEA-I 和DiL-acLDL雙染色陽性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs。

2.4體外EPCs血管生成能力檢測急性肺損傷組較正常對照組體外成血管數(shù)目下降，但兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；烏司他丁治療組較急性肺損傷組體外成血管數(shù)目增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3　3組成血管能力檢測比較(±s)

3討論

現(xiàn)有的研究主要考慮烏司他丁的內(nèi)皮保護(hù)作用為炎癥因子下降及炎癥細(xì)胞減少導(dǎo)致內(nèi)皮功能保護(hù)[4-6]。但在我們的實(shí)驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)烏司他丁能增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的歸巢數(shù)目，在體內(nèi)經(jīng)免疫組化觀察到肺毛細(xì)血管密度增加，在體外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)同樣發(fā)現(xiàn)經(jīng)烏司他丁組治療后內(nèi)皮祖細(xì)胞的成血管能力提高。為此，認(rèn)為烏司他丁的內(nèi)皮保護(hù)作用，作用于內(nèi)皮祖細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮功能改善，修復(fù)肺泡毛細(xì)血管屏障，減少肺部滲出。

內(nèi)皮祖細(xì)胞在內(nèi)皮保護(hù)起到主要的作用，內(nèi)皮祖細(xì)胞組織歸巢至受損的肺毛細(xì)血管起到修復(fù)的作用。有研究表明在急性肺損傷動(dòng)物模型中大約有50%的肺毛細(xì)血管丟失，所以利用內(nèi)皮祖細(xì)胞拯救肺毛血管是現(xiàn)在新的研究方向。參與肺血管[7]的修復(fù)有以下研究：Suratt 等[8]的研究認(rèn)為內(nèi)皮祖細(xì)胞參與內(nèi)皮修復(fù)提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，證明內(nèi)皮祖細(xì)胞參與肺血管的修復(fù)，在接受男性造血干細(xì)胞移植的女性病人肺組織中(活檢或尸檢)觀察到含有Y染色體的內(nèi)皮細(xì)胞，證明外源性內(nèi)皮祖細(xì)胞在受者肺組織中定植并分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮祖細(xì)胞可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，在研究中發(fā)現(xiàn)，油酸誘導(dǎo)的急性肺損傷兔的肺中線粒體中的血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、錳超氧化物歧化酶(Mn super oxide dismutase)蛋白水平升高，這兩種酶對抵抗腫瘤壞死因子(TNF-α)介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷及凋亡起到重要作用[1]。內(nèi)皮祖細(xì)胞除了直接的內(nèi)皮修復(fù)作用還有免疫調(diào)節(jié)功能 保護(hù)減少細(xì)胞內(nèi)黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)，P-選擇素(P-selectin)蛋白使炎癥細(xì)胞滲出減少[9]。

從本實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞能歸巢至受損的肺血管及參與肺血管內(nèi)皮修復(fù)和血管新生。并且發(fā)現(xiàn)烏司他丁有直接引起內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管功能提高的作用。

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(本文編輯郭懷印)

(收稿日期：2015-12-19)

中圖分類號：R563R256.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．06．011

文章編號：1672-1349(2016)06-0594-03

通訊作者：謝南姿，E-mail：luobangzhen100@sina.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(No.81000244)；上海市自然科學(xué)基金(No.12ZR1428400)