香菇液體菌種深層培養(yǎng)工藝研究

劉世玲　唐　悅　尚東妮　江　坤　曹現(xiàn)濤　李克彬　田少平（. 宜昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，湖北 宜昌 443000；. 湖北五林中地農(nóng)業(yè)科技有限公司，湖北 宜昌 443000）

張文斌2　李文德2　王治江1*　王少秋1（1. 河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2. 甘肅省張掖市經(jīng)濟作物推廣站，甘肅 張掖 734000）

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香菇液體菌種深層培養(yǎng)工藝研究

劉世玲1唐悅2尚東妮2江坤2曹現(xiàn)濤2李克彬1田少平2*
（1. 宜昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，湖北 宜昌 443000；2. 湖北五林中地農(nóng)業(yè)科技有限公司，湖北 宜昌 443000）

摘要目的：在香菇液體菌種培養(yǎng)基篩選、50 L培養(yǎng)罐及500 L培養(yǎng)罐工藝試驗的基礎(chǔ)上，探索10 m3培養(yǎng)罐培養(yǎng)工藝。試驗結(jié)果：培養(yǎng)液3 h溶氧開始下降，4 h pH開始降低，102 h菌絲球固形物體積達(dá)67.7%。結(jié)論：運用500 L培養(yǎng)罐作為種子罐，可顯著縮短香菇菌絲在培養(yǎng)罐中的適應(yīng)時間；香菇液體菌種深層培養(yǎng)在24 ℃，溶氧90%～98%，攪拌速率120 rpm條件下比較適宜；最佳接種時間為80～130 h，接種量為每個接種孔10 mL。關(guān)鍵詞香菇； 液體菌種； 培養(yǎng)； 工藝

據(jù)統(tǒng)計，目前我國的香菇產(chǎn)量約占世界香菇總產(chǎn)量的70%，香菇產(chǎn)業(yè)關(guān)系到國家食用菌產(chǎn)業(yè)的整體水平。目前香菇的種植主要依靠固體菌種，而固體菌種具有成本高、生長周期長、接種效率低等缺點。隨著科技的進(jìn)步，食用菌生產(chǎn)方式由家庭作坊式操作、季節(jié)性生產(chǎn)的模式向設(shè)施化、工廠化、周年化、規(guī)模化生產(chǎn)模式轉(zhuǎn)變，采用液體深層培養(yǎng)工藝制備食用菌菌種已成為研發(fā)熱點[2]。金針菇、杏鮑菇等在工廠化生產(chǎn)中已運用液體菌種[3～4]。液體菌種具有生長周期短、菌絲生長快、多點萌發(fā)、出菇整齊等優(yōu)勢[5]。目前香菇液體菌種的研究多停留在實驗室搖瓶和中小型培養(yǎng)罐中培養(yǎng)的階段[6～8]，尚未在實際生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用。本研究在前期培養(yǎng)基篩選、搖瓶培養(yǎng)、50 L培養(yǎng)罐及500 L培養(yǎng)罐培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用10 m3培養(yǎng)罐深層培養(yǎng)香菇液體菌種，對培養(yǎng)過程全程監(jiān)控，并進(jìn)行接種試驗，以期獲得可運用于實際生產(chǎn)的香菇液體菌種培養(yǎng)工藝。

1　材料和方法

1.1材料

（1）香菇菌種808A。

（2）主要儀器和設(shè)備。超凈工作臺，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌鍋，電子天平，無菌培養(yǎng)接種罐，5 mL移液槍，500 L培養(yǎng)罐，10 m3培養(yǎng)罐。

（3）培養(yǎng)基。菌種活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。種子及培養(yǎng)罐培養(yǎng)基相同，配方為糖蜜1%，豆粕粉0.3%，玉米粉0.3%，KH2PO40.05%，MgSO40.03%，另在培養(yǎng)罐中添加消泡。PDA培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基于121 ℃下滅菌。

1.2方法

（1）供試菌種活化。在無菌條件下將母種菌絲接種至PDA斜面上，24 ℃下培養(yǎng)7天后挑選菌絲濃密、潔白、健壯的試管作為供試菌株。

（2）液體菌種的制備。將2塊1 cm3的菌絲塊接種至含100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，24 ℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160 rpm。6天后擴大培養(yǎng)，即將液體菌種轉(zhuǎn)接至裝有2 L培養(yǎng)基的5 L三角瓶中，接種量為5%，培養(yǎng)方法與上述相同。5天后運用無菌培養(yǎng)接種罐接種到500 L培養(yǎng)罐培養(yǎng)，接種量為2%，4天后得到種子。

（3）培養(yǎng)罐滅菌。培養(yǎng)罐及配套設(shè)備進(jìn)行空消，時間1 h，溫度121 ℃，壓力0.1～0.15 MPa；配料后（裝料系數(shù)為70%，初始pH調(diào)至5.0）培養(yǎng)原料液和培養(yǎng)罐進(jìn)行實消，時間1 h，溫度121 ℃，壓力0.1～0.15 MPa；流加罐實消，時間1 h，溫度121 ℃，壓力0.1～0.15 MPa。

（4）接種。實消后，培養(yǎng)液溫度冷卻到24～25 ℃時接種，將種子液接入10 m3培養(yǎng)罐，接種量為5%。

（5）參數(shù)控制及培養(yǎng)過程中的檢測要求。培養(yǎng)基初始pH調(diào)為5.0；整個培養(yǎng)過程中溫度設(shè)定為24 ℃，壓力0.13 MPa；整個培養(yǎng)過程中要求溶氧量為90%～98%之間（通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速與空氣流量實現(xiàn)）；攪拌轉(zhuǎn)速：前60 h，100～140 rpm；后期60～120 h，150 rpm（視溶氧值和菌絲球直徑大小進(jìn)行調(diào)整）；進(jìn)風(fēng)量100～250 L/min（根據(jù)溶氧值調(diào)整）；前24 h，取兩次樣，取樣要求檢測菌濃（菌體濃度）和離線pH值，同時鏡檢香菇菌絲形態(tài)并檢測是否染雜。25～120 h每隔6 h取一次樣，取樣要求檢測總菌濃和離線pH值，同時鏡檢香菇菌絲形態(tài)并檢測是否染雜；整個培養(yǎng)過程中要求每小時記錄一次在線pH、通風(fēng)量、溶氧、溫度、堿加入量等數(shù)據(jù)。

（6）菌絲萌發(fā)試驗。香菇菌絲體培養(yǎng)進(jìn)行到第4天、第5天和第6天時，分別取樣接種至栽培袋中。栽培料配方為木屑68%、棉籽殼10%、麩皮20%、蔗糖1%、石膏1%，含水量60%左右，栽培袋大小15×30（cm）。滅菌冷卻后無菌條件下用打孔器在栽培袋側(cè)面打1個孔，大小為1.0×1.0×10.0（cm），用移液槍在側(cè)面及袋口接種，接種量為每孔10 mL。接種后用膠帶及時封住接種口，每天接60袋，置于24 ℃環(huán)境下暗培養(yǎng)，觀察菌絲萌發(fā)情況。

2　結(jié)果與分析

2.10.5 m3種子罐

（1）pH的變化。培養(yǎng)的前30 h pH變化緩慢，由4.97降低至4.89，表明這一階段香菇菌絲處在適應(yīng)期，代謝緩慢；至59 h pH下降到4.44；79 h至100 h之間pH下降較快，表明期間菌絲體大量增多，代謝活躍，產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)。這個階段應(yīng)該是菌絲生長的對數(shù)期至穩(wěn)定期。

（2）溶氧的變化。在菌絲培養(yǎng)進(jìn)行65 h后溶氧開始降低，88 h后溶氧量恢復(fù)至初始值。此期間通過增加攪拌轉(zhuǎn)速（最高150 rpm）和增大通風(fēng)量（閥門開量由10%增至12%）來保持培養(yǎng)基中的溶氧量，以保證菌絲體生長代謝所需要的氧氣。這期間菌絲代謝旺盛，需要消耗大量的氧氣，而造成培養(yǎng)基中溶氧量明顯下降。溶氧開始下降的時間點（65 h）與開始流加堿的時間點（59 h）較一致，同樣標(biāo)志香菇菌絲體大量繁殖，菌絲此時處于對數(shù)生長期。

（3）菌絲球固形物體積的變化。由于培養(yǎng)基中有難以分解的豆粕粉顆粒等固體物質(zhì)，通過檢測培養(yǎng)基中菌絲球的干重或濕重難以真實反映菌絲體的生物量。本研究通過檢測取樣樣品中培養(yǎng)固形物（主要是香菇菌絲體）的體積占樣品總體積的百分?jǐn)?shù)用以反映生成的香菇菌絲體的量。具體方法為每隔6 h取樣一次，將樣品混勻后取100 mL倒入100 mL量筒中，靜置2 h后等固形物體積不再減少，記錄固形物的體積，并計算固形物的百分比。

由圖1可知，香菇菌絲體的量在30 h之前很少，無法統(tǒng)計，36 h開始明顯增多，達(dá)12.4%，此時菌絲體處于對數(shù)生長期。66 h至96 h間固形物體積增長很快，由24%增至70%，平均每小時的增加量達(dá)1.53%，96 h固形物的體積比達(dá)到70%。

圖1　0.5 m3種子罐內(nèi)的固形物的體積比與培養(yǎng)時間的關(guān)系

（4）菌絲形態(tài)的變化。正常的香菇雙核菌絲體細(xì)長，壁光滑，隔膜不明顯，隔膜之間的間距較大，且有明顯的鎖狀聯(lián)合，可作為區(qū)分香菇菌絲體和其他雜菌的一個重要的標(biāo)志。在培養(yǎng)過程中取樣檢測發(fā)現(xiàn)4天之前香菇菌絲檢測形態(tài)正常，分節(jié)少，壁光滑，有明顯的鎖狀聯(lián)合標(biāo)志。

2.210 m3培養(yǎng)罐

（1）pH的變化。培養(yǎng)前12 h pH變化緩慢，由4.63下降至4.55，表明這一階段香菇菌絲處在適應(yīng)期；48 h至96 h之間pH下降較快，表明期間菌絲體大量增多，代謝活躍，產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，應(yīng)該是菌絲生長的對數(shù)期至穩(wěn)定期。

（2）溶氧的變化。溶氧在菌絲培養(yǎng)進(jìn)行3 h后開始降低，33 h后溶氧量保持在100%不變。此期間通過增加攪拌轉(zhuǎn)速（最高150 rpm）來保持培養(yǎng)基中的溶氧量，以保證菌絲體生長代謝所需要的氧氣。溶氧開始下降的時間點（3 h）與pH開始降低的時間點（4 h）較一致，同樣標(biāo)志香菇菌絲體逐漸開始繁殖。

（3）菌絲球固形物體積的變化。由于培養(yǎng)基中有難以分解的豆粕粉顆粒等固體物質(zhì)，通過檢測培養(yǎng)基中菌絲球的干重或濕重難以真實反映菌絲體的生物量。本研究通過檢測取樣樣品中發(fā)酵液固形物（主要是香菇菌絲體）的體積占樣品總體積的百分?jǐn)?shù)來反映生成的香菇菌絲體的量。具體方法為每隔6 h取樣一次，將樣品混勻后取100 mL倒入100 mL量筒中，靜置2 h后等固形物體積不再減少，記錄固形物的體積，并計算固形物的百分比。

從圖2看，香菇菌絲體的量12 h之前很少，無法統(tǒng)計，24 h開始明顯增多，達(dá)15%，此時菌絲體處于對數(shù)生長期，相對于pH和溶氧量，這個指標(biāo)反映的香菇菌絲的生長時期較滯后，因為只有菌絲體累積到一定量時才能反映出來。24 h 至48 h之間固形物體積增長很快，由17.3%增至42.8%，平均每小時的增加量達(dá)1.06%，102 h固形物體積比達(dá)到67.7%，此后不再增加，反而開始減少，這可能是因菌絲體開始自溶造成的。

（4）菌絲形態(tài)的變化。在培養(yǎng)過程中，取樣檢測發(fā)現(xiàn)香菇菌絲檢測形態(tài)正常，菌絲分節(jié)少，壁光滑，有明顯的鎖狀聯(lián)合標(biāo)志，未感染雜菌。

圖2　10 m3培養(yǎng)罐內(nèi)的固形物體積比與培養(yǎng)時間的關(guān)系

（5）菌絲在栽培袋中的萌發(fā)情況。在香菇菌絲體深層培養(yǎng)96 h、120 h、144 h時分別取樣10 mL接種至栽培袋的頂部和側(cè)面。接種3天后可以觀察到香菇菌絲開始萌發(fā)，10天后菌絲吃料直徑約25 cm，頂部接種菌絲完全覆蓋料面并沿側(cè)面延伸約4 cm。重復(fù)3次接種，菌絲生長無明顯差異。

3　討　論

食用菌液體菌種深層培養(yǎng)，一個重要問題是防止污染，一旦液體菌種被細(xì)菌或真菌污染，整個培養(yǎng)罐的菌種都將被丟棄，經(jīng)濟損失慘重。

通氣量、攪拌速率、溫度和pH是影響香菇液體菌種培養(yǎng)的重要因素。其中控制通氣量和攪拌速率是為調(diào)節(jié)溶氧和菌絲球大小。在菌絲生長的對數(shù)期，有大量菌絲體生成，代謝旺盛，對氧氣的消耗多，此時要適當(dāng)增加通風(fēng)量和攪拌速率。試驗中發(fā)現(xiàn)若攪拌速率過快（150 rpm）會導(dǎo)致菌絲球過小。結(jié)合觀測溶氧、pH及菌絲體生成量，可以推測菌絲培養(yǎng)處于哪一階段。

香菇菌絲液體培養(yǎng)時間和接種量對液體菌種在栽培袋中的萌發(fā)至關(guān)重要。在研究中發(fā)現(xiàn)香菇菌絲體深層培養(yǎng)4天、5天、6天時，分別接種，10天后菌絲體生長無明顯差異，且生長狀況良好，說明這期間均適合接種，至于后續(xù)表現(xiàn)是否有差異，仍待進(jìn)一步觀測。

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【說明】2016年第1期P43-47發(fā)表的“真姬菇液體培養(yǎng)特性及胞外酶的活性研究”，文章的作者單位，按原稿為：

張文斌2李文德2王治江1*王少秋1
（1. 河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2. 甘肅省張掖市經(jīng)濟作物推廣站，甘肅 張掖 734000）

特此說明。

Research on submerged culture technology of liquid spawn of Lentinula edodes

Liu Shiling1Tang Yue2Shang Dongni2Jiang Kun2Cao Xiantao2Li Kebin1Tian Shaoping2

（1. YiChang Academy of Agricultural Sciences, Yichang Hubei 443000；
2. HuBei WuLin Land Agricultural Science & Technology CO., LTD, Yichang Hubei 443000）

AbstractObjective: Research the submerged culture technology of liquid spawn of Lentinula edodes with 10 m3 volume fermenter based on the media and technology of 50 L and 500 L volume fermenters. Results: pH began to decline at 4 hours after inoculating; dissolved oxygen tension began to decline at 3 hours after inoculating; the volume ratio of mycelia reached 67.7% at 102 hours after inoculating. Conclusions: The risk of contamination could be reduced effectively by inoculating with sterile culture and 500 L volume fermenter which has been patented ; the proper condition for submerged culture of L.edodes spawn was 24 ℃, dissolved oxygen tension between 90%～98%, agitation speed 120 rpm; the optical inoculating period was 96～144 hours, inoculation volume was 10 mL.

Key wordsLentinula edodes; liquid spawn; culture; technology

中圖分類號：S646

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：2095-0934（2016）02-100-04

作者簡介：劉世玲（1966—），女，正高職高級工程師，主要從事應(yīng)用微生物學(xué)方面的研究工作。E-mail：lling.s@163.com*通訊作者：田少平（1979—），男，高級園藝師，主要研究方向為食用菌栽培育種及產(chǎn)業(yè)化。E-mail：wh201206@126.com