熒光PCR技術在從業人員傷寒痢疾快速篩查中的應用

陳玲，魏麗娜，吳步東，馮貞玉，王巍哈爾濱市疾病預防控制中心，黑龍江哈爾濱　150000

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熒光PCR技術在從業人員傷寒痢疾快速篩查中的應用

陳玲，魏麗娜，吳步東，馮貞玉，王巍
哈爾濱市疾病預防控制中心，黑龍江哈爾濱150000

［摘要］目的將實時熒光PCR技術應用于食品及公共場所從業人員肛拭標本的沙門菌與志賀菌檢測,對國家衛生標準WS/T454-2014《從業人員預防性健康檢查沙門菌志賀菌檢驗方法》技術方案進行實驗認證，評價這一新技術開展作為快速檢測從業人員體檢腸道致病菌（傷寒、痢疾）檢測工作方法的適用性，以替代落后的細菌培養法檢測手段的可行性。方法對一定時間從業人員體檢的肛拭子,同時用PCR篩查法和傳統培養法進行志賀菌和沙門菌對比檢測,充分比較兩者的檢出率、靈敏度、特異性、工作效率、人力成本和耗材成本。結果PCR篩查法陽性檢出率1.6‰;傳統培養法陽性檢出率0.76‰;PCR篩查法的靈敏度和特異性分別為100%和99.97%,具有操作安全簡便、結果客觀性強、方法便于規范統一、質量控制措施可操作性強等特點。結論PCR篩查法檢測技術對健康體檢人員的腸道致病菌進行快速篩查可以使檢驗的時間得以縮短,而且特異度強、靈敏度高,兼具時效性與客觀性,進而防止發生食物中毒及腸道傳染病傳播。更適合基層實驗室規范統一地開展健康帶菌檢測工作。

［關鍵詞］熒光PCR；傷寒痢疾；快速篩查

食品與公共場所從業人員攜帶腸道致病菌者，是嚴重危害公眾健康的重大問題，也是造成食品污染和食物中毒的間接因素。目前哈爾濱市對從業人員腸道致病菌的篩查一直沿用傳統的國標方法，通常需要5～7 d才能檢出病原體，存在檢驗時間長，靈敏度低的缺點［1］。WS/ T454-2014《從業人員預防性健康檢查沙門菌志賀菌檢驗方法》技術方案以經典培養法為依據，利用實時熒光PCR法靈敏、快速的優點和經典培養方法準確可靠的優點相結合，從而探討建立高效、準確、省力的新方案。

1資料與方法

1.1一般資料

對哈爾濱市2014年12月—2015年12月從業人員隨機抽樣，用肛拭子采集糞便標本11 800份，分別用傳統和PCR兩種方法進行檢測，分比較兩者的檢出率、靈敏度、特異性、工作效率、人力成本和耗材成本，以評價新方法的可行性［2］。

1.2儀器設備

（1）SLAN-96P全自動醫用PCR分析儀；（2）SCAN-4全自動微生物生化鑒定儀（德國）。

1.3試劑

（1）沙門氏菌和志賀氏菌雙色實時熒光PCR檢測試劑盒及配套采樣器増菌液（深圳市生科源生物公司）［3］；（2）SS瓊脂培養基、三糖鐵瓊脂（北京陸橋）；（3）沙門氏菌和志賀氏菌診斷血清（寧波天潤）。

1.4實驗步驟

對11800份體檢標本參照WS/T454-2014《從業人員預防性健康檢查沙門菌志賀菌檢驗方法》技術方案用實時熒光PCR試劑盒進行實時熒光PCR檢測［4］。

（1）標本采集。從業人員體檢使用深圳市生科源技術有限公司生產的MABSKY多功能采樣器（沙門/志賀通用增菌液型）進行標本采集。采樣方法：第一，將采樣桿緩慢插入肛門內2～3 cm，最大深入長度不超過5 cm，即采樣桿指示刻度。第二，手腕部輕輕用力使采樣頭貼著直腸內壁順時針旋轉1～3圈。將采樣桿輕緩抽出。

（2）標本增菌。第一，收集標本，并送至檢驗室。第二，掰斷采樣器頭部，將采樣器放入恒溫培養箱內進行37℃恒溫培養7～24 h。

（3）標本處理。①Pooling混合：先將pooling混合管（本案專配耗材，也可使用1.5 mL離心管代替）放置在配套的管架上，然后取前增菌后多功能采樣器，掰斷采樣器頭部，手指輕壓采樣器管壁，直接滴取2滴（約80 чL）至pooling管。按照每10份標本混合成1份混合標本的要求進行Pooling混合操作。

②離心:標本混合完成后,將模塊和標本水平對稱，離心機內以12 000 rpm的離心5 min。

③吸液、混勻:離心完后，首先棄上清，其次加DNA提取液50 чL/管，懸浮混勻。

④加熱：將盛有混勻的標本于100℃加熱5 min。

⑤再離心：標本加熱完畢以后，放入離心機內以12 000 rpm的離心2 min。

⑥加樣：第一，按照標本數（N）+陰陽性對照各一份，計算需要的實時熒光PCR試劑（N+2）；第二，取出分裝配好的沙門志賀雙色檢測試劑8聯PCR反應管放于離心甩液器上離心5 s，開蓋待加樣；第三，標本離心完畢后，從離心機內取出標本，然后取5 чL上清液,加入到PCR反應管管壁內，蓋好管蓋轉ABI7500儀器上機檢測。

（4）熒光PCR檢測。①標本檢測：實時熒光PCR儀檢測；②標本反應體系：總體積為25 чL；③PCR反應條件：50℃：2 min，（1個循環）；95℃：3 min；（1個循環）；95℃：5S，55℃：1 min采集熒光；（40個循環）。

（5）培養法確認與報告。①PCR檢測陰性的標本：所有標本均報告為陰性。

②PCR檢測沙門氏菌陽性的組，將混合標本所對應組（10份）標本挑出，進行沙門顯色/XLD瓊脂平皿劃線分離培養。

③PCR檢測志賀氏菌陽性的組，將混合標本所對應組（10份）標本挑出，進行XLD/麥康凱瓊脂平皿分離培養。

④增菌后標本進行培養法后期生化血清鑒定。

同時對11 800份體檢標本參照《食品衛生微生物學沙門氏菌檢驗》（GB-T4789.4-2003）和《食品衛生微生物學志賀氏菌檢驗》（GB-T4789.5-2003）進行檢測。

2結果

（1）兩種方法陽性率對比，見表1。

表1兩種方法檢測陽性率對比

（2） 。

表2沙門氏菌檢測結果準確率對照

表3志賀氏菌檢測結果準確率對照

3討論

該次實驗11 800份標本中，檢出沙門菌10例和志賀菌9例（以確診病例為準），相比傳統檢測方法靈敏度提高［5］。在實際檢測工作中，還為從業人員體檢工作帶來如下進步。

3.1采樣環節

（1）技術方案所配套的生科源“多功能采樣器”為一體話專業設計，集合了采樣環節所涉及的采樣、運輸、增菌、取樣多功能需求。

（2）標本采集。多功能采樣器已配置滅菌增菌液，省去了傳統方法的采樣瓶清洗、配液、消毒環節，可直接使用。既省去了傳統方法采樣器準備工作所需大量人工，也消除了該環節的污染風險；

（3）標本運輸。多功能采樣器采用全塑料組件，不破碎、不漏液，可避免標本運輸過程意外產生的樣本交叉污染［6］。

（4）取樣檢測。無需開啟采樣器瓶蓋，避免標本取樣的操作失誤和標本污染［8］。

3.2檢測環節

（1）篩查結果儀器自動判讀，消除主觀因素；（2）檢驗時間大幅縮短；（3）PCR實驗操作一人即可完成，減少了工作量；（4）檢驗數據電腦管理，原始結果可追溯。

該文PCR試劑應用改良分子信標設計。由于改良分子信標更短，與靶序列結合更緊密，擴增條件要求不嚴，是在基層能更好利用的PCR方法［8］。綜合來看，該技術方案為整體技術方法，提供了從采樣到PCR篩查所需要配套的多功能采樣器、PCR試劑盒以及各技術環節的配套細節設計［9］。新技術方案是剛頒布的國家衛生標準，填補了這一領域的技術空白，是一個實用、簡便、有效的技術規范。

［參考文獻］

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Realtime Fluorescence PCR Examination Method is in Rapid Detection of Salmonella and Shigella Among Employees

CHEN Ling,WEI Li-na,WU Bu-dong,FENG Zhen-yu,WANG Wei
Harbin Center for Disease Control and Prevention,Harbin,Heilongjiang Province,150000 China

［Abstract］Objective Real-time fluorescent PCR method was applied to food and public employees anus swabs of specimens of salmonella and shigella detection.FOR the experimental certification on national health standard（WS/T454-2014）.Evaluation applicability of this new method to carry out a rapid detection from employees on physical examination of intestinal pathogenic bacteria（typhoid and dysentery）.Methods Comparison test on anal swab of employees for a period of time by using the PCR method and the classic method at the same time .Fully compared their detection rate,sensitivity,specificity,efficiency,labor and material costs.Results The positive rate of PCR method is 1.6‰and the classic method is 0.76‰.The sensitivity and the specificity of the PCR method is 100%and 99.97%respectively.Method is safe in operation to facilitate unified specification,quality control measures is strong operability,etc.Conclusion Real-time fluorescent PCR method allows rapidly detection of intestinal pathogenic bacteria .The method is high specificity,high sensitivity,both timeliness and objectivity to prevent the occurrence of food poisoning and the spread of intestinal infectious diseases.It is suitable for laboratory to carry out rapid detection from employees on physical examination of intestinal pathogenic bacteria normatively.

［Key words］Realtime PCR；Typhoid and dysentery；Rapid detection

收稿日期：（2016-01-09）

DOI：10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.05.125

［中圖分類號］R440

［文獻標識碼］A

［文章編號］1672-5654（2016）02（b）-0125-03