龍葵堿對胰腺癌細胞裸鼠移植瘤的抑制作用及機制研究

周怡，李影，孔鴻儒，張青順，周蒙滔，孫洪偉

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325000，1.肝膽胰外科；2.手術室）

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龍葵堿對胰腺癌細胞裸鼠移植瘤的抑制作用及機制研究

周怡1，李影2，孔鴻儒1，張青順1，周蒙滔1，孫洪偉1

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325000，1.肝膽胰外科；2.手術室）

［摘 要］目的 探討龍葵堿對胰腺癌細胞SW1990裸鼠移植瘤的抑制作用并初步研究其作用機制。方法建立胰腺癌細胞SW1990的裸鼠荷瘤模型，隨機分為對照組和實驗組，每組10只。腫瘤接種成功第2周起對照組和實驗組分別腹腔注射溶媒（含1‰二甲亞砜）1 mL、龍葵堿10 mg/kg，隔天給藥1次，共給藥2周。每次給藥結束用游標卡尺記錄腫瘤大小。給藥結束后頸椎脫臼處死裸鼠，測量瘤體重量并計算抑瘤率，留取新鮮腫瘤組織用RT-PCR和免疫組化檢測Bcl-2、Bax和Caspase-3基因mRNA和蛋白表達情況。結果 與對照組相比，實驗組裸鼠腫瘤生長受到顯著抑制（P＜0.05），實驗組的腫瘤組織Bcl-2表達陽性率明顯降低（實驗組90% vs 對照組46%，P＜0.01），Bax（實驗組38% vs 對照組70%，P＜0.01）和Caspase-3（實驗組22% vs 對照組74%，P＜0.01）的表達陽性率明顯升高。結論 龍葵堿在裸鼠體內能顯著抑制人胰腺癌細胞SW1990的增殖，此抑制作用呈明顯的時間依賴性。龍葵堿發揮上述作用的機制可能在于誘導胰腺癌細胞凋亡。

［關鍵詞］龍葵堿；胰腺癌；凋亡；裸鼠

胰腺癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，起病隱匿且病因一直不夠明確。在我國，胰腺癌在腫瘤相關的死亡人數中排名第6位，其1年生存率＜20%，5年生存率＜6%，平均存活時間＜6個月［1-2］。胰腺癌雖以手術切除為主，但由于其起病隱匿且侵襲力較強，故早期診斷比較困難，多數患者就診時已屬晚期，無法行根治性切除。即使能夠手術切除，患者術后復發率也極高。鑒于胰腺癌的低切除率和高復發率，化學藥物治療（化療）在胰腺癌的綜合治療中仍有重要地位。目前，從中草藥中尋找新的理想化療藥物是研究方向之一。龍葵堿（C45H73NO15，分子量868.07，Solanine）提取自茄科植物龍葵分子式，具有顯著的細胞毒作用和抗核分裂作用，我們在前期的研究中發現：龍葵堿在體外能顯著抑制人胰腺癌Panc-1、SW1990細胞的增殖，誘導其凋亡［3-4］。但其在體內是否有相似的藥理作用尚未被證實，本實驗通過建立胰腺癌細胞裸鼠荷瘤模型，觀察龍葵堿在裸鼠體內對腫瘤生長的抑制情況，并初步探討其機制。

1　材料和方法

1.1材料

人胰腺癌細胞株SW1990（源自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心）；龍葵堿（安徽蕪湖甙爾塔醫藥科技有限公司）；RPMI1640培養基（Gibco公司）；溶媒二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司），胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物工程材料研究所），Bcl-2、Bax、Caspase-3鼠抗人抗體（ABGENT公司）。

1.2實驗動物

4～6周齡健康BALB/c雌性裸鼠，體重18～20 g，購于中科院上海實驗動物中心，飼養于SPF級屏障系統的潔凈層流架內，控制室溫在（25±1）℃，相對濕度40%～60%。

1.3細胞培養

人胰腺癌細胞Panc-1用含10%的滅活胎牛血清的RPMI 1640培養基于37 ℃、5% CO2條件下培養，傳代，取對數生長期的細胞用于實驗研究。

1.4胰腺癌裸鼠荷瘤模型的建立及實驗分組

取對數生長期的細胞，0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化液消化細胞并制成單細胞懸液，準確計數，以4×106個細胞接種于裸鼠的背腹側，接種1周后查看腫瘤生長情況，有腫瘤生長證明接種成功。待腫瘤接種成功第2周起將實驗裸鼠隨機分成對照組、實驗組，每組10只，分別給予含1‰ DMSO的1640培養液1 mL，龍葵堿10 mg/kg。每隔1天給藥1次，共計給藥2周。

1.5指標檢測

（1）每次給藥結束，用游標卡尺記錄腫瘤大小；（2）2周給藥結束后頸椎脫臼處死模型，取下腫瘤組織稱重記錄，通過其重量計算龍葵堿的抑瘤率=（1-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重）×100%；（3）將取下的腫瘤組織研磨提取RNA，Real-time PCR檢測Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表達；（4）免疫組化檢測Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達，胞漿中出現棕黃色顆粒為Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白陽性細胞，400倍視野觀察5個連續切片選癌細胞密集處的計數，平均100個細胞中陽性細胞小于25%為陰性，大于25%為陽性。

1.6統計學分析

應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。計量資料實驗數據以（±s）表示，兩組數據比較采用t檢驗；計數資料采用x2檢驗。P＜0.05認為有統計學差異。

2　結果

2.1龍葵堿對胰腺癌裸鼠移植瘤生長的影響

2.1.1腫瘤生長曲線：通過記錄腫瘤體積來反映藥物作用的情況：腫瘤體積=最長徑×最短經2/2。

圖1　給藥后各組腫瘤生長曲線

2.1.2抑瘤率：試驗結束后頸椎脫臼處死裸鼠后取下腫瘤組織稱重。與對照組裸鼠瘤重（1.35±0.314）g相比，實驗組裸鼠瘤重（0.926±0.352）g明顯降低（P=0.023），抑瘤率為31.41%。

2.2各組腫瘤組織Bcl-2，Bax和Caspase-3 mRNA的表達

2.2.1Bcl-2 mRNA的表達：龍葵堿作用后腫瘤組織Bcl-2 mRNA的表達顯著降低，即：若對照組腫瘤組織Bcl-2 mRNA的表達量為1，則實驗組腫瘤組織Bcl-2 mRNA的表達量僅為0.44，有統計學差異（P＜0.01）。如表1所示。

表1　各組腫瘤組織內Bcl-2 mRNA的表達

2.2.2Bax mRNA的表達：龍葵堿作用后腫瘤組織Bax mRNA的表達顯著升高，即：若對照組腫瘤組織Bax mRNA的表達量為1.00，則實驗組腫瘤組織Bax mRNA的表達量高達3.56，有統計學差異（P＜0.01）。如表2所示。

表2　各組腫瘤組織內Bax mRNA的表達

2.2.3Caspase-3 mRNA的表達：龍葵堿作用后腫瘤組織Caspase-3 mRNA的表達顯著升高，即：若對照組腫瘤組織Caspase-3 mRNA的表達量為1.00，則實驗組腫瘤組織Caspase-3 mRNA的表達量高達3.20，有統計學差異（P＜0.01）。如表3所示。

表3　各組腫瘤組織內Capase-3 mRNA的表達

2.3各組腫瘤組織中Bcl-2，Bax和Caspase-3蛋白的表達

與對照組相比，龍葵堿作用后腫瘤組織Bcl-2蛋白的表達顯著下降（46% vs 90%，P＜0.01）；Bax蛋白的表達顯著升高（70% vs 38%，P＜0.01）；Caspase-3 mRNA的表達顯著升高（74% vs 22%，P＜0.01），如表4所示。

表4　各組腫瘤組織Bcl-2，Bax和Caspase-3陽性視野計數

實驗組和對照組腫瘤組織Bcl-2，Bax和Caspase-3蛋白免疫組織化學染色的代表圖片如圖2～7所示。

圖2　對照組腫瘤組織Bcl-2蛋白表達（×400）

圖3　實驗組腫瘤組織Bcl-2蛋白表達（×400）

圖4　對照組腫瘤組織Bax蛋白表達（× 400）

圖5　實驗組腫瘤組織Bax蛋白表達（× 400）

圖6　對照組腫瘤組織Caspase-3蛋白表達（×400）

圖7　實驗組腫瘤組織Caspase-3蛋白表達（×400）

3　討論

眾所周知，化療在胰腺癌治療中具有很高的地位，但令無數腫瘤學家頗為尷尬的是目前臨床應用的化療藥物（如5-FU、吉西他濱等）療效并不好，且極易出現化療耐藥［5］。因此，積極尋找有效的化療藥物治療胰腺癌是當務之急。在前期的體外實驗中，我們發現龍葵堿可以明顯抑制胰腺癌細胞PANC-1的增殖，且此增值抑制作用有明顯的時間和濃度依賴性；此增殖抑制作用是通過誘導其凋亡實現的，可見其將來成為化療藥物的潛力［3-4］，本研究就是在此基礎上，探討龍葵堿在裸鼠體內是否有相似的藥理作用。

3.1龍葵堿在裸鼠體內能顯著抑制人胰腺癌細胞SW1990的增殖

本研究中，我們首先建立胰腺癌裸鼠荷瘤模型，然后采用龍葵堿干預，通過記錄腫瘤的生長曲線，發現實驗組的腫瘤生長明顯放緩，抑瘤率達到31.41%。由此結果可見，龍葵堿在裸鼠體內確能顯著抑制人胰腺癌細胞SW1990的增殖。

3.2龍葵堿在裸鼠體內抑制人胰腺癌細胞SW1990的增殖是通過誘導凋亡實現的

在前期的體外實驗中，我們發現龍葵堿可以明顯抑制胰腺癌細胞PANC-1的增殖，此增殖抑制作用發生的機制在于龍葵堿誘導胰腺癌細胞凋亡，因此我們推測龍葵堿在裸鼠體內對胰腺癌細胞的抑制作用也具有相似的機制。為證實此設想，我們通過RT-PCR和免疫組化的方法分別從基因和蛋白水平檢測了腫瘤組織內Caspase-3的表達量。因為Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，Caspase-3作為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能，它的水平間接反映了細胞的凋亡水平［6］。實驗結果顯示：實驗組腫瘤組織的Caspase-3表達量明顯高于對照組，且基因和蛋白水平結果吻合，因此，實驗組的癌細胞凋亡水平明顯高于對照組。

3.3龍葵堿在裸鼠體內誘導人胰腺癌細胞SW1990凋亡的機制探討

細胞凋亡的出現是多種基因互相作用、綜合調節的結果［7］。細胞凋亡可以通過多種通路實現，線粒體凋亡通路是最重要的細胞凋亡途徑之一。在線粒體凋亡通路中，Bcl-2家族蛋白質調控線粒體中促凋亡因子的釋放，在細胞凋亡與存活中起著重要的作用。

本研究結果顯示，實驗組龍葵堿作用于胰腺癌裸鼠動物模型后，與對照組相比Bcl-2的表達量明顯減少，而Bax表達量則逐漸增加，與本課題組前期體外細胞試驗結果相符合，進一步證實了龍葵堿具有誘導胰腺癌凋亡的作用。我們推測其相關機制可能是由于Bax基因表達量增加，從而抑制Bcl-2基因的表達，使Bcl-2/Bax蛋白之間形成同二聚體，其遷移至線粒體外膜，通過改變線粒體膜的通透性，最終使細胞色素C從線粒體中釋放到胞漿中進而觸發了下一級Caspase家族的級聯反應，從而發揮作用。

參考文獻：

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［7］ RAFF M C. Social controls on cell survival and cell death ［J］. Nature， 1992， 356（6368）: 397-400.

（本文編輯：魯翠濤）

·論著 基礎研究·

Inhibitory effect of Solanine on apoptosis of human pancreatic cancer implanted on nude mice and its mechanism

Z HOU Yi1， LI Ying2， KONG Hong-ru1， ZHANG Qing-shun1， ZHOU Meng-tao1， SUN Hong-wei1.1Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery；2Department of Operating Theatre， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， Zhejiang 325000， China

AbstractObjective To investigate the inhibitory effect and mechanism of Solanine on human pancreatic cancer cells SW1990 implanted on nude mice. Methods Pancreatic cancer cells SW1990 which were in the state of logarithmic phase were implanted on nude mice. After two weeks of the implantation， the nude mice were randomized into two groups （n=10）: control group， 1‰ dimethylsulfoxide （DMSO） 1 mL was injected into the abdominal cavity， once every other day； test group， Solanine at dose of 10 mg/kg was injected into the abdominal cavity， once every other day. All treatment lasted for two weeks. After the treatment， the nude mice were killed and then the tumor weight and the inhibition rate were determined； the mRNA expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 were analyzed with RT-PCR and the protein expression were analyzed with immunohistochemistry. Results Compared with the control group， the tumor growth of the nude mice in the test group was significantly inhibited （P＜0.05）. The results of RT-PCR and immunohistochemistry test showed that Solanine increased the expression of Caspase-3 and Bax， at the same time， inhibited the Bcl-2 （all P＜0.01）. Conclusion Solanine can significantly inhibit the proliferation of pancreatic cancer cells SW1990 in nude mice in a time-dependent manner. Furthermore， the inhibitory effect of solanine may be achieved by the apoptosis induction in pancreatic cancer.

Key wordsSolanine； pancreatic cancer； apoptosis； nude mice

［通訊作者簡介］孫洪偉，主治醫師，碩士，E-mail：sunhongwei1@163.com。

［第一作者簡介］周怡（1992-），女，浙江溫州人，本科。

［基金項目］浙江省中醫藥管理局資助項目（2011ZA072）；溫州市公益性科技計劃項目（Y20150228）；溫州市龍灣區科技發展計劃項目（2010YS5）。

［收稿日期］2015-09-21

［中圖分類號］R735.9

［文獻標識碼］A

DOI：10.11952/j.issn.1007-1954.2016.03.009