健脾養血祛風方對脾虛證慢性濕疹小鼠模型干預的實驗研究

朱卉雯，田　靜,李忻紅，馬賢德，馮常青，王　敏

(1. 遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032；2. 遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032)

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健脾養血祛風方對脾虛證慢性濕疹小鼠模型干預的實驗研究

朱卉雯1,2，田靜1,2,李忻紅2，馬賢德1，馮常青2，王敏2

(1. 遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032；2. 遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032)

[摘要]目的探討健脾養血祛風方對脾虛證慢性濕疹小鼠模型的作用機制。方法將50只健康雄性小鼠隨機分為空白組、模型組、西藥組、中藥高劑量組及中藥低劑量組。除空白組外，其余小鼠均制備脾虛證慢性濕疹模型。中藥高、低劑量組給予相應劑量健脾養血祛風方干預，西藥組給予鹽酸左西替利嗪干預，空白組和模型組均給予等量生理鹽水。灌胃14 d后觀察各組小鼠皮膚組織病理變化情況、耳腫脹度(耳質量差)、耳厚度差、脾臟指數及胸腺指數。結果中藥高、低劑量組以及西藥組小鼠病變皮膚組織病理示表皮角化過度不明顯，棘層肥厚明顯減輕，真皮內炎性浸潤顯著減少，內皮細胞腫脹減輕。與空白組比較，其他各組小鼠耳厚度差及耳腫脹度均顯著增加(P均<0.05)；各給藥組小鼠耳厚度差及耳腫脹度均明顯低于模型組(P均<0.05)，各給藥組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。與空白組比較，其他各組小鼠脾臟指數及胸腺指數均顯著升高(P均<0.05)；各給藥組小鼠脾臟指數及胸腺指數均明顯低于模型組(P均<0.05)，各給藥組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。結論健脾養血祛風方能夠顯著減輕脾虛證慢性濕疹小鼠模型耳腫脹度，減少耳厚度差；下調脾虛證慢性濕疹小鼠模型增高的脾臟指數及胸腺指數；抑制病變組織炎性反應，改善慢性濕疹皮損的病理結構。該方對脾虛證慢性濕疹小鼠模型具有較好的抗炎、抗過敏作用。

[關鍵詞]健脾養血祛風方；脾虛；慢性濕疹；胸腺指數；脾臟指數

慢性濕疹常由急性、亞急性濕疹反復發作不愈轉變而來，也可一開始即呈現慢性炎癥，表現為患部皮膚浸潤肥厚，皮損上有結痂和脫屑，隨后出現色素沉著和苔蘚樣變，皮膚增厚部位可出現皸裂而致疼痛，損害較局限，邊界也較急性濕疹清楚?，F代醫學認為慢性濕疹與Ⅳ型超敏反應有關，即由 T 淋巴細胞介導的遲發型變態反應。中醫學對本病的認識歷史悠久，《素問·至真要大論》有言：“諸痛癢瘡，皆屬于心，諸濕腫滿，皆屬于脾?！边@是對皮膚瘡瘍病因病機的最早概括，揭示了本病雖病在表，而與五臟病機相連，尤其與脾關系密切，對后來有關濕疹病因病機的探討、發展起了指導作用。本研究觀察了健脾養血祛風方對脾虛證慢性濕疹小鼠模型耳腫脹度(耳質量差)、耳厚度差、脾臟指數、胸腺指數及組織病理變化的影響，旨在探討該方對脾虛證慢性濕疹小鼠模型的可能作用機制，為臨床應用提供理論依據和實驗基礎。

1實驗資料

1.1動物昆明種SPF級健康小鼠50只，雄性，6～8周齡，體質量18～22 g，由遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(遼):2003-0016。分籠飼養，自然光照，自由飲水進食。實驗設計及實施過程中嚴格遵循動物實驗的3R原則[1]。

1.2試劑2，4-二硝基氯苯(DNCB)，軍事醫學院藥材供應站，批號991223。丙酮，國藥集團化學試劑(沈陽)公司，批號20110805。DNCB用丙酮配制成7%和0.1%濃度備用。

1.3儀器電子天平(上海精密科學儀器有限公司)，WS2-261-79型電熱恒溫水浴箱(北京長安科學儀器廠)，550酶標儀(美國Bio-Rad公司)，石蠟包埋機(EG1150型，德國徠卡公司生產)，打孔器(YLS-Q4型，山東省醫學科學院研制)，脫水機(LEICA300型，德國徠卡公司生產)，切片機(LEICA RM2235型，德國徠卡公司生產)，數碼顯微鏡(OLYMPUS BX41型，日本OLYMPUS公司生產)。

1.4藥物健脾養血祛風方藥物組成：黨參15 g、白術15 g、山藥20 g、生地20 g、當歸20 g、制首烏20 g、雞血藤20 g、防風25 g、蒺藜10 g、白蘚皮20 g、甘草15 g。中藥飲片均購自遼寧中醫藥大學附屬醫院藥局，以傳統方法煎煮濃縮，制成煎劑。鹽酸左西替利嗪片(商品名：迪皿，重慶華邦制藥有限公司，國藥準字h10040249，5 mg/片)，用蒸餾水溶解制成混懸液。

1.5實驗方法采用隨機數字表法將50只小鼠隨機分為空白組、模型組、西藥組、中藥高劑量組和中藥低劑量組，每組10只。除空白組外，其他小鼠均制作脾虛證慢性濕疹模型。先采用小劑量反復DNCB涂抹的方法建立慢性濕疹模型[2-4]：致敏前將小鼠腹部去毛，面積約2 cm×2 cm，第1天外涂以7% DNCB 25 μL致敏，第2天強化1次；第5天給小鼠背部剪毛，面積約2 cm×2 cm，第6天開始在鼠右耳雙面及背部剪毛區分別涂抹0.1% DNCB 5 μL、15 μL激發，每隔3 d 1次，共4次。觀察造模各組動物的行為狀態，若出現皮膚明顯增厚、粗糙、干燥、暗紅斑及褐色結痂，有少量毛發生長，動物回頭舔舐頻繁，煩躁不安明顯即為造模成功。于小鼠慢性濕疹模型造模第12天起采用番瀉葉致脾虛的方法制作小鼠脾虛模型[5]：給予小鼠灌服100%番瀉葉煎劑 0.5 mL/只，1次/d，連續7 d。觀察造模各組動物的行為狀態：①大便溏泄；②食少納呆；③消瘦，體質量減輕；④毛色無光澤；⑤蜷縮聚堆；⑥神態萎靡，易疲勞。①②項為主癥，③～⑥項為兼癥，具備全部主癥及2項兼癥時即認為脾虛造模成功[6-7]。末次致敏激發24 h后，中藥高、低劑量組分別給予含原生藥量1.33 g/鼠和0.33 g/鼠的健脾養血祛風方煎液灌胃，西藥組予鹽酸左西替利嗪0.03 mg/鼠灌胃，給藥劑量根據人與小鼠體表面積比例進行換算，所有藥物均配制成0.4 mL溶液。空白組及模型組均給予等量生理鹽水灌胃。均連續灌胃14 d，末次給藥后24 h，稱體質量后處死小鼠，取材送檢。

1.6觀察項目

1.6.1形態學觀察取小鼠耳部皮膚組織用10%福爾馬林溶液固定以做病理組織學檢查，蘇木精-伊紅(HE)染色, 光鏡下觀察各組小鼠耳部病變組織炎癥細胞浸潤情況。

1.6.2指標檢測處死小鼠后立即剪下小鼠左右耳廓備檢。用6 mm打孔器取同部位的左右兩耳片，用微測量卡尺測定小鼠耳中部厚度，計算左右耳厚度差；用電子天平稱量耳片質量，以左右耳片質量之差計為腫脹程度。處死小鼠后取出完整脾臟和胸腺，去掉筋膜及脂肪組織，天平稱量脾臟和胸腺質量，脾臟(胸腺)質量除以該鼠體質量得脾臟(胸腺)指數。

2結果

2.1一般情況空白組小鼠精神狀態好，皮毛色澤鮮亮，反應靈敏，飲水飲食正常，便質軟，體質量穩定，體溫無明顯波動；其他各組小鼠在造模后，背部皮膚逐漸干燥、粗糙、肥厚，并因摩擦等機械性刺激而出現血痂，皮損處毛發稀疏，出現時而煩躁、回頭舔舐等慢性濕疹表現；同時還出現懶動、嗜臥、毛發無光澤、反應遲鈍、飲食減少、腹瀉、便質稀、體質量減輕、體溫低等脾虛表現。各給藥組小鼠相互摩擦及回頭舔舐明顯減少，粗糙、肥厚減輕，毛發增多。中藥高、低劑量組小鼠除上述表現外，用藥第2天起大便逐漸正常，飲食亦趨于正常，體質量逐漸增加，體溫回至正常。

2.2耳部皮膚組織病理表現空白組表皮無角化過度、增厚及海綿形成，真皮層無炎細胞浸潤，無血管擴張，見圖1。模型組表皮角化過度，棘層肥厚，細胞間水腫不明顯，無表皮內水皰，真皮血管周圍炎性浸潤明顯，見圖2。西藥組表皮角化過度不明顯，棘層肥厚明顯減輕，真皮內炎性浸潤顯著減少，內皮細胞腫脹減輕，見圖3。中藥高劑量組與西藥組結構變化基本相似，見圖4。中藥低劑量組表皮角化過度及棘層肥厚，真皮內炎性浸潤減少，內皮細胞腫脹減輕，見圖5。

圖1　空白組小鼠耳部皮膚組織病理改變(HE，×400)

圖2　模型組小鼠耳部皮膚組織病理改變(HE，×400)

圖3　西藥組小鼠耳部皮膚組織病理改變(HE，×400)

圖4　中藥高劑量組小鼠耳部皮膚組織病理改變(HE，×400)

2.3耳厚度差及腫脹程度與空白組比較，其他各組小鼠耳厚度差及耳腫脹度均顯著增加(P均<0.05)；各給藥組小鼠耳厚度差及耳腫脹度均明顯低于模型組(P均<0.05)，各給藥組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

2.4脾臟指數和胸腺指數與空白組比較，其他各組小鼠脾臟脂數及胸腺指數均顯著升高(P均<0.05)；各給藥組小鼠脾臟指數及胸腺指數均明顯低于模型組(P均<0.05)，各給藥組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

圖5　中藥低劑量組小鼠耳部皮膚組織病理改變(HE，×400)

組別n耳厚度差/mm腫脹程度/mg空白組100.006±0.0090.436±0.210模型組100.260±0.035①3.810±0.513①西藥組100.068±0.027①②1.503±0.638①②中藥高劑量組100.088±0.027①②1.511±0.520①②中藥低劑量組100.126±0.025①②1.562±0.443①②

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表2　各組小鼠胸腺指數及脾臟指數比較±s，mg/g)

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

3討論

慢性濕疹所表現出的皮膚肥厚、干燥粗糙、脫屑、抓痕、瘙癢劇烈等，與中醫的“脾虛”有著密切關系[8-9]。脾主運化，脾虛運化無權，水液不能正常輸布，而余濕羈留不去，病情頑固不化；脾虛生化乏源，散精失調，可致血虛，日久化燥生風，肌膚失于濡潤，最終形成了脾弱血虛風燥的證候。健脾養血祛風方正是在這一理論基礎上形成的治療脾虛慢性濕疹的中藥方劑，方中黨參、白術健脾益氣除濕，共為君藥；生地、當歸養血活血潤燥，共為臣藥；制首烏、雞血藤養血活血通絡，防風、蒺藜、白蘚皮祛風除濕止癢共為佐藥；甘草補脾益氣，調和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏健脾除濕、養血潤燥、祛風止癢之效。

慢性濕疹主要表現為皮膚的慢性炎癥反應，目前被普遍認為與IV型超敏反應有關，其病理變化相似，特點是伴有組織損傷和炎癥反應，因此臨床表現有時不易區別。實驗結果顯示，除空白組外，其余各組均不同程度表現出表皮增厚，角化過度，炎細胞浸潤，內皮細胞腫脹。模型組小鼠耳部病理結果證實，慢性濕疹模型復制成功，其病理變化基本符合慢性濕疹病理改變。而各給藥組小鼠耳部病理變化較模型組均有不同程度的改善，并與耳腫脹度、脾臟指數及胸腺指數的改變相符合。

本實驗通過觀察藥物干預后各組小鼠耳厚度差、耳腫脹度、脾臟指數及胸腺指數的改變，結果發現致敏后的各組小鼠耳厚度差及耳腫脹度均較空白組有明顯變化；與模型組比較，各給藥組小鼠耳腫脹度明顯減輕，局部炎癥反應明顯減輕，各給藥組間比較差異無統計學意義。說明慢性濕疹的發生與局部炎癥密切相關，同時健脾養血祛風方對局部炎癥反應有良好的抑制作用。

脾臟是最大的外周免疫器官，成熟B淋巴細胞聚集于此，與細胞免疫關系密切。胸腺是機體中樞免疫器官，是T淋巴細胞成熟發育的場所。人體的脾臟指數和胸腺指數與體質量成正比，是反映脾臟、胸腺免疫功能的重要指標[10]。脾臟指數和胸腺指數的變化直接反映了機體免疫功能狀態。本研究發現，脾虛證慢性濕疹模型組小鼠胸腺指數及脾臟指數均明顯高于空白組，各給藥組胸腺指數和脾臟指數均明顯低于模型組。同時發現隨著各項指標的改變，慢性濕疹的皮損也在逐漸改善，小鼠脾虛的癥狀也逐漸改善，說明免疫功能的改變與慢性濕疹及脾虛都密切相關，而健脾養血祛風方可以很好地調節低下的免疫功能，從“扶正祛邪”的角度達到治療脾虛慢性濕疹的目的。

綜上所述，健脾養血祛風方有較好的抗炎作用，同時能夠通過抑制胸腺及脾臟指數，從而調節低下的細胞免疫功能，進而達到健脾益氣祛濕的功效，值得臨床應用與推廣。

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Study on intervention of Jianpi Yangxue Qufengfang on mice model of syndrome of spleen deficiency with chronic eczema

ZHU Huiwen1,2, TIAN Jing1,2, LI Xinhong1,2, MA Xiande1, FENG Changqing2, WANG Min2

(1. Liaoning University of TCM, Shenyang 110032, Liaoning, China; 2.The Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM, Shenyang 110032, Liaoning, China)

Abstract:Objective It is to investigate the possible therapeutic mechanism of Jianpi Yangxue Qufengfang (JPYXQFF) on mice model of syndrome of spleen deficiency with chronic eczema. Methods Fifty healthy male mouse were randomly divided into blank group, model group, western medicine group, TCM high dose group and TCM low dose group. Except blank group, all groups were induced to models of syndrome of spleen deficiency with chronic eczema. The animals were intervened with corresponding dose of JPYXQFF in TCM high and low group, and with levocetirizine hydrochloride in western medicine group, with equal dose of physiological saline in blank and model group. The pathological changes of skin, ear swelling degree, ear thickness difference, spleen index, thymus index were observed after 14 days of intervention. Results TCM high and low dose group and western medicine group had obvious inhibitory effect on the local inflammation, and can improve the pathological of skin lesions. There was significant difference between the blank group and the others in ear swelling degree and ear thickness. (all P<0.05); the ear swelling degree and ear thickness difference in all treatment group were significantly thinner than that in the model group (all P<0.05), but there was no significant difference among the treatment groups (all P>0.05). The spleen index and thymus index were significantly increased in the other groups compared with the blank group (all P<0.05), and those indexes were decreased in the treatment groups compared with the model group (all P<0.05), but there was no significant difference among the treatment groups (all P>0.05). Conclusion JPYXQF can significantly reduce the ear swelling degree and ear thickness difference of mouse model of spleen deficiency syndrome with chronic eczema, and decrease the spleen index and thymus index, inhibit the inflammatory reaction of the tissue lesions, improve pathological structure of chronic eczema lesions. It has better anti-inflammatory and anti allergic effects on the mouse model of spleen deficiency syndrome of chronic eczema.

Key words:Jianpi Yangxue Qufengfang; syndrome of spleen deficiency; chronic eczema; spleen index; thymus index

[作者簡介]朱卉雯，女，碩士，主治醫師，研究方向為超敏反應性皮膚病的中醫藥治療。[通信作者]田靜，E-mail：18002413280@163.com

[基金項目]遼寧省中醫藥學(專)科能力建設項目(2011-lnzyxzk-03，遼寧省衛生廳)；遼寧省教育廳高等學校科學研究項目(L2012342)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.03.003

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)03-0235-04

[收稿日期]2015-05-18