黃芩苷對視網膜母細胞瘤HXO-RB44細胞增殖、凋亡及侵襲性的影響

秦　靜，張　堅，張純濤，魏常虹，李裕欽，段大鵬

(1. 陜西省人民醫院，陜西 西安 710068；2. 西安醫學院第二附屬醫院，陜西 西安 710038)

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黃芩苷對視網膜母細胞瘤HXO-RB44細胞增殖、凋亡及侵襲性的影響

秦靜1，張堅1，張純濤2，魏常虹1，李裕欽1，段大鵬1

(1. 陜西省人民醫院，陜西 西安 710068；2. 西安醫學院第二附屬醫院，陜西 西安 710038)

[摘要]目的觀察黃芩苷對視網膜母細胞瘤HXO-RB44細胞增殖活性、凋亡指數、侵襲性及PCNA、CAS-3蛋白表達水平的影響，并探討其可能機制。方法將對數生長期HXO-RB44細胞制成單細胞懸液接種于96孔培養板中，分為對照組及50，100，200 μg/mL黃芩苷組并給予相應劑量藥物處理，MTT法測各組細胞增殖抑制率，流式細胞術測細胞凋亡指數，Transwell侵襲小室實驗測細胞侵襲能力，Western Blot法檢測PCNA、CAS-3蛋白表達情況。結果MTT結果顯示黃芩苷對HXO-RB44細胞增殖有明顯抑制作用，且呈時間依賴性；流式細胞術結果顯示黃芩苷各組中HXO-RB44細胞凋亡指數顯著高于對照組；Transwell侵襲小室實驗顯示黃芩苷能明顯降低HXO-RB44細胞的侵襲能力，均呈劑量依賴性；Western blot顯示隨著黃芩苷濃度的增加，PCNA蛋白表達逐漸下降，而CAS-3蛋白表達增加，呈劑量依賴性。結論黃芩苷可抑制視網膜母細胞瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡，并抑制其侵襲能力，其可能是通過調控PCNA、CAS-3蛋白的表達，激活相關細胞凋亡信號通路來完成的。

[關鍵詞]視網膜母細胞瘤；黃芩苷；增殖；侵襲

視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)是原發于視網膜的一種眼內惡性腫瘤，嚴重危害患者的視力和生命[1]。其治療手段雖然有多種，但是大多數預后不佳，給患者的生存質量造成了嚴重影響[2-3]。現代藥理研究表明，黃芩苷在清除氧自由基、調節免疫、促進細胞凋亡以及抗腫瘤等多方面均有作用[4]。本實驗采用不同濃度(50，100，200 μg/ mL)黃芩苷作用于視網膜母細胞瘤HXO-RB44細胞，檢測細胞增殖活性、凋亡指數、侵襲性以及PCNA、CAS-3蛋白的表達水平，從而探討其對視網膜母細胞瘤的影響及其可能機制，為臨床治療提供理論基礎。

1實驗資料

1.1細胞來源及主要實驗試劑人視網膜母細胞瘤HXO-RB44細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；胎牛血清、青鏈霉素購自美國Gibco公司；MTT、二甲基亞砜及所有抗體(CAS-3、PCNA)購自美國Sigma公司；細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司。

1.2實驗方法

1.2.1視網膜母細胞瘤HXO-RB44細胞培養液氮中取出凍存的HXO-RB44細胞，放入37 ℃水浴箱中使之迅速融化。在超凈工作臺內吸出細胞懸液，注入含5 mL培養液的離心管中，低速離心3 min后棄上清，培養液吹打后移至細胞培養瓶，加入含10%～15%胎牛血清、100 μg/mL青鏈霉素的DMEM培養液中，置于37 ℃培養箱培養。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，當細胞生長貼壁融合度為80%～90%時進行傳代培養。

1.2.2MTT法檢測HXO-RB44細胞增殖抑制率將對數生長期HXO-RB44細胞制成單細胞懸液，計數后接種于96孔培養板中，分為對照組及50，100，200 μg/mL黃芩苷組，對照組不加藥物，其余按組別加入不同濃度黃芩苷，孵育24 h后每孔加入20 μL MTT，培養4 h去上清，每孔加入150 μL DMSO，終止反應。將96孔板移入平板振蕩器，水平震蕩10 min。酶聯免疫檢測儀于490 nm波長處測定每孔吸光度(OD)值，以空白對照孔的OD值調零，并記錄結果。結果以每組4孔的均數±標準差表示，增殖抑制率=(l-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡率采用 Annexin V/PI雙染色法，取對數生長期的HXO-RB44細胞，0.25%胰酶消化后制成細胞懸液，以1×105mL-1細胞密度接種于細胞培養板中，對照組不加藥物，其余按組別加入不同濃度黃芩苷，用4 ℃預冷的PBS洗細胞2次，胰酶消化后，1 500 r/min離心5 min后棄上清，收集細胞，用PBS重新懸浮細胞，調節細胞濃度，取100 μL細胞懸液(約1×105個細胞)，1 500 r/min離心5 min后棄上清，加入500 μL的1×Binding Buffer，加入5 μL Annexin V-FITC，再加入10 μL PI，輕輕混勻，室溫下避光反應5～10 min，上流式細胞儀分析。

1.2.4Transwell侵襲小室實驗測細胞侵襲力將Matrigel膠鋪于培養小室濾膜上，每孔20～30 μL, 37 ℃過夜凝膠，在膜的另一面涂上纖維黏連蛋白，約5×105細胞/mL 200 μL加入小室內，培養24 h后擦去膜上層細胞，將膜取下，甲醛室溫固定30 min，蘇木素染色，乙醇逐級脫水，二甲醛透明后，用刀片裁下膜，置于載玻片上，鏡下計數(平均計數 4個視野)。

1.2.5Western blot檢測HXO-RB44細胞PCNA、CAS-3蛋白表達情況培養的HXO-RB44細胞同步化后，對照組不加藥物，其余按組別加入不同濃度黃芩苷，提取HXO-RB44細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度。按《分子克隆實驗指南》所述方法進行SDS-PAGE電泳，電泳至溴酚藍抵達分離膠底部結束電泳，取下凝膠并做標記，入電轉緩沖液平衡5 min后轉膜。纖維素膜一側靠正極，膠一側靠負極。然后抗原抗體反應，并用辣根過氧化物酶化學增強劑顯色反應。蛋白的表達水平根據GAPDH進行標化，通過軟件進行灰度掃描、定量。

2結果

2.1各組HXO-RB44細胞增殖抑制率MTT法測定結果顯示，黃芩苷對HXO-RB44細胞的增殖有明顯抑制作用。在72 h時，對照組和50，100，200 μg/mL黃芩苷組HXO-RB44細胞增殖抑制率分別為(20.98±1.69)%，(32.68±1.21)%，(41.05±2.33)%，(57.54±3.66)%，各組間比較差異均有統計學意義(P均<0.05)；各組HXO-RB44細胞增殖抑制率均隨時間延長而逐漸增高。見圖1。

圖1　MTT法測定各組HXO-RB44細胞增殖抑制率

2.2各組HXO-RB44細胞凋亡率Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞儀檢測結果發現，對照組和50，100，200 μg/mL黃芩苷組HXO-RB44細胞凋亡率分別為10.45%，22.19%，36.74%和54.89%，各組間比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖2。

2.3各組HXO-RB44細胞侵襲性transwell侵襲小室實驗測定結果發現，對照組和50，100，200 μg/mL黃芩苷組穿膜細胞數分別為357.86±36.12，269.48±29.35，187.84±23.57，121.59±16.43。各組間比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。

2.4各組HXO-RB44細胞PCNA、CAS-3蛋白表達情況Westtern blot分析測量各蛋白的表達水平，結果顯示隨著黃芩苷濃度的增加，PCNA蛋白的表達水平逐漸下降，而CAS-3蛋白的表達水平逐漸升高，經檢驗差異有統計學意義(P均<0.05)。見圖3。

3討論

視網膜母細胞瘤最早是由荷蘭醫生Pawius于1597年首次報道，在全世界發病率約為1∶20 000[5]，其發病率有逐年上升的趨勢[6]。目前趨向于個性化綜合治療，其中包括化學減容法、外照射放療、激光光凝、鞏膜敷貼放療、溫熱療法、冷凍療法、眼球摘除、眼眶內容剜除和針對轉移腫瘤的全身化療以及多種方法聯合治療[7-8]。隨著各種治療方法的進步以及早期診斷和及時治療的實現，患者生存率得到了極大提高，但在發展中國家和不發達國家，生存率仍低于50%[9-10]。

圖2　各組HXO-RB44細胞凋亡率

圖3　各組HXO-RB44細胞PCNA、CAS-3蛋白表達水平

黃芩始載于《神農本草經》，歸草部山草類，為唇形科多年生植物黃芩的干燥根。傳統中醫認為黃芩苷具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，并被用于肝癌、肺癌以及直腸癌等的治療。現代藥理研究表明，黃芩的作用主要包括抗腫瘤、抗病毒、消熱鎮痛等[11-12]。隨著國際上對黃芩苷研究的逐步深入,發現黃芩苷可清除氧自由基，減輕組織的缺血再灌注損傷，調節免疫，促進細胞凋亡以及抗腫瘤和HIV。

本實驗中MTT檢測結果顯示，黃芩苷對HXO-RB44細胞增殖具有明顯抑制作用，這種抑制作用表現出良好的時間和劑量依賴性。利用流式細胞儀對細胞凋亡率的分析發現，與對照組相比，經黃芩苷作用后細胞凋亡率逐漸升高。transwell侵襲小室實驗結果發現，黃芩苷各組穿膜細胞數明顯減少。表明黃芩苷可抑制視網膜母細胞瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡，并抑制細胞的侵襲轉移。

腫瘤的發生是多途徑、多步驟的，細胞增殖與凋亡之間的平衡失調與腫瘤的發生發展密切相關[13]。PCNA是DNA復制所必需的，并已被證明是腫瘤增殖的一個重要標記，Survivin的表達已被證實與惡性腫瘤中PCNA和CAS-3表達相關聯[14-15]。Caspase家族是細胞凋亡的執行者，決定了細胞凋亡的形態和生物化學改變[16]。本研究發現，不同濃度黃芩苷處理細胞后，可下調PCNA蛋白的表達，上調CAS-3蛋白的表達，且呈劑量依賴性，提示黃芩苷可能通過調節PCNA和CAS-3蛋白的表達參與視網膜母細胞瘤的增殖和凋亡。

綜上所述，黃芩苷可抑制視網膜母細胞瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡，抑制細胞侵襲、轉移，可能是通過調節PCNA與CAS-3蛋白的表達，從而激活相關細胞凋亡信號通路來完成的，這可能為視網膜母細胞瘤提供一個潛在的治療策略。

[參考文獻]

[1]Kim JH,Kim JH,Yu YS,et al. Anti-tumor activity of arginine deiminase via arginine deprivation in retinoblastoma[J]. Oncol Rep，2007，18(6):1373-1377

[2]Shields CL,Meadows AT,Leahey AM,et al. Continuing challen-ges in the management of retinoblastoma with chemotherapy[J]. Retina,2004,24(6):849-862

[3]Beck MN,Balmer A,Dessing C,et al. First-line chemotherapy with local treatment can prevent external-beam irradiation and enucleation in low-stage intraocular retinoblastoma[J]. J Clin Oncol,2006,18(15):2881-2887

[4]張喜平，田華，程琪輝. 黃芩苷的藥理作用研究現狀[J]. 中國藥理學通報，2003，19(11):1212-1215

[5]Gallie BL,Zhao J,Vandezande K,et al. Global issues and opportunities for optimized retinoblastoma care[J]. Pediatr Blood Cancer, 2007,49(7 Suppl):1083-1090

[6]Schiavetti A,Hadjistilianou T,Clerieo A,et al. Conservative therapy in intraocular retinoblastoma :response/recurrence rate[J]. J Pediatr Hematol Oncol,2005,27(1):3-6

[7]Shields CL,Meadows AT,Leahey AM,et al. Continuing challenges in the management of retinoblastoma with chemotherapy[J]. Retina,2004,24(6):849-862

[8]Beck MN,Balmer A,Dessing C,et al. First-line chemotherapy with local treatment can prevent external-beam irradiation and enucleation in low-stage intraocular retinoblastoma[J]. J Clin Oncol,2006,18(15):2881-2887

[9]Suzuki S,Kaneko A. Management of intraocular retinoblastoma and ocular Prognosis[J]. Int J Clin Oneol,2004,9(1):1-6

[10] Yanagisawa T. Systemic chemotherapy as a new conservative treatment for intraocular retinoblastoma[J]. Int J Clin Oncol,2004,9(1):13-24

[11] Miocinovic R,Mc-Cabe NP,Keck RW,et al. In vivo and in vitro effect of baicalein on human prostate cancer cells[J]. Int J Oncol,2005,26(1):241-246

[12]FranekKJ,ZhouZ,ZhangWD,etal.InvitrostudiesofbaicalinaloneorincombinationwithSalviamiltiorrhizaextractasapotentialanti-canceragent[J].IntJOncol,2005,6(1):217-224

[13] Wolrf B，Green DR. Suicidal Tendencies:Apoptotic cell death by caspase family proteinase[J]. J Bion Chem,1999,274(29):200-249

[14] Wang W,Luo H,Wang A. Expression of survivin and correlation with PCNA in osteosarcoma[J]. J Surg Oncol,2006,93(7):578-584

[15] Zou J,Gan M,Mao N,et al. Sensitization of osteosarcoma cell line SaOS-2 to chemotherapy by downregulating survivin[J]. Arch Med Res,2010,41(3):162-169

[16] Evan GI,Vousden KH. Proliferation,cell cycle and apoptosis in cancer[J]. Nature,2001,411(6835):342-348

Effects of baicalin on tumor proliferation, apoptosis and invasive capacity of retinoblastoma HXO-RB44 cell

QIN Jing1, ZHANG Jian1, ZHANG Chuntao2, WEI Changhong1, LI Yuqin1, DUAN Dapeng1

(1. Shaanxi Provincial People’s Hospital, Xi’an 710068, Shaanxi, China; 2. The Second Affiliated Hospital of Xi’an Medical College, Xi’an 710038, Shaanxi, China)

Abstract:Objective It is to observe the effect of baicalin on tumor proliferation activity, apoptosis index, invasive capacity and PCNA, CAS-3 proteins expression of retinoblastoma HXO-RB44 cell, and explore the molecular mechanisms. Methods The logarithmic growth phase HXO-RB44 cell were made into single cell suspension and inoculated in 96 well plates, and were divided into baicalin 50, 100, 200 μg/mL group and control group, and then the cells were treated with different concentrations of baicalin and equal volume of normal saline. MTT assay was used to detect cell proliferation inhibition rate, and flow cytometry was used to detect apoptosis index, and Transwell invasion assay was used to detect cell invasive capacity, and Western blot assay was used to determine the protein expression levels of PCNA and CAS-3. Results The MTT assay found that baicalin had significantly reduced the proliferative activities of HXO-RB44 cells in a time-dependent manner; the flow cytometric analysis results showed that the apoptosis index of HXO-RB44 cells in baicalin treated groups was markedly higher than that in the control group; Transwell invasion assay showed that the cell invasive capacity in baicalin treated groups was markedly lower than that in the control group; Western blot assays performed that the protein expression level of PCNA was gradually decreased, while CAS-3 expression was gradually increased with the increase of baicalin concentration in baicalin treated group. Conclusion Baicalin can inhibit the proliferation of HXO-RB44 cells, induced its apoptosis, and inhibit the invasion ability. The molecular mechanisms may through regulate the expression of PCNA and CAS-3, and active the apoptosis related signaling pathway.

Key words:retinoblastoma; baicalin; proliferation; invasive capacity

[作者簡介]秦靜，女，碩士，研究方向為眼底疾病。[通信作者]段大鵬，E-mail:15829086908@163.com

[基金項目]陜西省中醫管理局課題 (13-JC029)；西安市科技計劃項目(SF1315(4))

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.03.004

[中圖分類號]R-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)03-0239-04

[收稿日期]2015-06-17