山楂葉總黃酮對肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

劉雪峰

(河北省邢臺市第一醫(yī)院，河北 邢臺 054001)

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山楂葉總黃酮對肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

劉雪峰

(河北省邢臺市第一醫(yī)院，河北 邢臺 054001)

[摘要]目的研究山楂葉總黃酮(HLF)對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法將120只清潔級雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、山楂葉總黃酮低劑量組(15 mg/kg)、山楂葉總黃酮中劑量組(30 mg/kg)、山楂葉總黃酮高劑量組(60 mg/kg)和舒血寧組。除假手術(shù)組外，其余組均采用無創(chuàng)動脈夾夾閉左肺門45 min然后去夾的方法制備肺缺血再灌注損傷大鼠模型，各給藥組大鼠于術(shù)前30 min通過腹腔注射給予相應(yīng)藥物。再灌注2 h后，測定動脈血氧分壓[p(O2)]，計(jì)算肺組織濕/干質(zhì)量比(W/D)，HE染色觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變，TUNEL染色觀察肺細(xì)胞凋亡情況；檢測血清丙二醛(MDA)含量、髓過氧化物酶(MPO)活性及總抗氧化能力(T-AOC)水平，紫外可見分光光度計(jì)測定肺組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性。結(jié)果山楂葉總黃酮高劑量組p(O2)和血清T-AOC水平均明顯高于模型組(P均<0.05)，山楂葉總黃酮中、高劑量組大鼠血清MDA含量和MPO活性及肺組織W/D均顯著低于模型組(P均<0.05)；山楂葉總黃酮各劑量組大鼠肺組織病理學(xué)改變和肺細(xì)胞凋亡狀況均較模型組明顯好轉(zhuǎn)，以高劑量組效果最為顯著；山楂葉總黃酮中、高劑量組大鼠肺組織中SOD、CAT活性顯著高于模型組(P均<0.05)。結(jié)論山楂葉總黃酮對大鼠肺缺血再灌注損傷具有劑量依賴性的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與山楂葉總黃酮能夠有效提高機(jī)體自由基清除能力、抑制氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]山楂葉總黃酮；肺組織；缺血再灌注；保護(hù)作用

山楂葉是薔薇科山楂屬植物山里紅葉或山楂葉，為我國傳統(tǒng)中藥。山楂葉總黃酮(hawthorn leaves flavonoids，HLF)是指從山楂葉中提取的黃酮類化合物的總稱，其具有明顯的抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、抗腦缺血和心肌缺血等多種生物學(xué)活性[1-4]。本實(shí)驗(yàn)采用夾閉左肺門45 min后松夾的方法制備肺缺血再灌注損傷大鼠模型，研究山楂葉總黃酮對肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動物清潔級雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量240～280 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(冀)2008-1-003。

1.2藥物與試劑山楂葉總黃酮(長春三九生物制藥，批號：20140518)；舒血寧注射液(神威藥業(yè)有限公司，批號：201401027)；丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)、總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TUNEL檢測試劑盒購自美國密理博公司；水合氯醛購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3儀器DH-1型動物人工呼吸機(jī)(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；BS200 全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；UV-5500型紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；石蠟切片機(jī)(德國SLEE公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；FS-2組織勻漿機(jī)(金壇市盛威實(shí)驗(yàn)儀器廠)；24D臺式高速離心機(jī)(深圳市賽泰克生物科技有限公司)；300型血?dú)夥治鰞x(美國雅培公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法將120只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、山楂葉總黃酮低劑量組(15 mg/kg)、山楂葉總黃酮中劑量組(30 mg/kg)、山楂葉總黃酮高劑量組(60 mg/kg)和舒血寧組(4 mg/kg)，每組20只。除假手術(shù)組外，其余組大鼠均參照文獻(xiàn)[5]試驗(yàn)方法復(fù)制肺缺血再灌注大鼠模型：經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛實(shí)施麻醉后，氣管插管，連接動物呼吸機(jī)，于左胸第4—5肋間開胸，用無創(chuàng)血管夾閉左肺門，45 min后松夾恢復(fù)血流再灌注，整個(gè)過程輔助機(jī)械通氣；假手術(shù)組行手術(shù)通路，除不夾閉左肺門外，其余操作同手術(shù)組。各給藥組均于術(shù)前30 min腹腔注射給予相應(yīng)藥物干預(yù)，假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水。

1.5觀察項(xiàng)目

1.5.1動脈血氧分壓[p(O2)]的檢測再灌注2 h后，每組取10只腹腔注射10%水合氯醛實(shí)施麻醉，開腹經(jīng)腹主動脈取血，經(jīng)血?dú)夥治鰞x測定p(O2)。

1.5.2肺組織濕/干質(zhì)量比(W/D)的測定1.5.1取血完成后，每組取6只大鼠開胸取左肺下葉，沖洗干凈、濾紙吸干后稱質(zhì)量，為濕質(zhì)量(W)；置60 ℃烘箱24 h后稱質(zhì)量，為干質(zhì)量(D)，計(jì)算兩者之比為肺 W/D。

1.5.3肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察將1.5.1取血完成后每組剩余4只開胸取大鼠相同部位左肺下葉組織，4%多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋和切片(厚度為5 μm)，HE染色，然后通過光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠肺組織病理形態(tài)改變。

1.5.4肺組織細(xì)胞凋亡狀況觀察按照1.5.3方法步驟制備肺組織石蠟切片，根據(jù)TUNEL染色試劑盒說明進(jìn)行TUNEL染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察肺組織細(xì)胞凋亡狀況。

1.5.5血清MDA含量、MPO活性及總抗氧化能力(T-AOC)水平的檢測再灌注2 h后，取每組剩余10只大鼠腹腔注射10%水合氯醛實(shí)施麻醉，開腹經(jīng)腹主動脈取血，2 000 r/min離心10 min后取血清，按照試劑盒操作步驟，通過紫外可見分光光度計(jì)測定MDA含量、MPO活性及T-AOC水平。

1.5.6肺組織勻漿中SOD、CAT活性檢測將1.5.5取血后大鼠開胸取相同部位1.0 g左肺下葉組織，用冷生理鹽水沖洗干凈，剪碎后用組織勻漿器研磨勻漿，通過紫外可見分光光度計(jì)測定各組大鼠肺組織勻漿中SOD、CAT活性。

2結(jié)果

2.1各組大鼠p(O2)比較假手術(shù)組、模型組、山楂葉總黃酮低劑量組、山楂葉總黃酮中劑量組、山楂葉總黃酮高劑量組、舒血寧組p(O2)分別為(97.1±2.6)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)、(85.9±3.4)mmHg、(87.2±3.2)mmHg、(90.8±3.6)mmHg、(93.4±4.0)mmHg、(88.6±3.9)mmHg。模型組p(O2)明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)，山楂葉總黃酮高劑量組顯著高于模型組(P<0.05)。

2.2各組大鼠血清MDA含量、MPO活性以及T-AOC水平比較模型組大鼠血清MDA含量和MPO活性均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，T-AOC水平明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)；山楂葉總黃酮中、高劑量組MDA含量和MPO活性均明顯低于模型組(P均<0.05)，舒血寧組MDA含量明顯低于模型組(P均<0.05)，山楂葉總黃酮高劑量組T-AOC水平顯著高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠血清MDA含量、MPO活性以及

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05;②與模型組比較，P<0.05。

2.3各組大鼠肺組織W/D比較假手術(shù)組、模型組、山楂葉總黃酮低劑量組、山楂葉總黃酮中劑量組、山楂葉總黃酮高劑量組、舒血寧組肺組織W/D分別為4.9±0.3,6.5±0.5，6.1±0.6，5.7±0.4，5.5±0.4，5.8±0.6。模型組大鼠肺組織W/D明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，山楂葉總黃酮中、高劑量組和舒血寧組均明顯低于模型組(P均<0.05)。

2.4各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠肺組織未見異常，見圖1；模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細(xì)胞變性、壞死，肺泡內(nèi)存在大量滲出液體，炎癥細(xì)胞浸潤，見圖2；山楂葉總黃酮各劑量組和舒血寧組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)較模型組改善，其中山楂葉總黃酮高劑量組改善最為顯著，見圖3～6。

圖1　假手術(shù)組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變(HE，×400)

圖2　模型組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變(HE，×400)

圖3　山楂葉總黃酮低劑量組大鼠肺組織

圖4　山楂葉總黃酮中劑量組大鼠肺組織

2.5各組大鼠肺細(xì)胞凋亡狀況經(jīng)過TUNEL染色，凋亡細(xì)胞呈胞核黃染。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠肺組織存在極少量凋亡細(xì)胞，見圖7；模型組大鼠肺組織凋亡狀況較假手術(shù)組明顯加重，見圖8；山楂葉總黃酮各劑量組和舒血寧組大鼠肺組織凋亡狀況明顯減輕，以山楂葉總黃酮高劑量組改善最為顯著，見圖9～12。

圖5　山楂葉總黃酮高劑量組大鼠肺組織

圖6　舒血寧組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變(HE，×400)

圖7　假手術(shù)組大鼠肺細(xì)胞凋亡狀況(TUNEL，×400)

圖8　模型組大鼠肺細(xì)胞凋亡狀況(TUNEL，×400)

2.6各組大鼠肺組織勻漿中SOD、CAT活性比較模型組大鼠肺組織勻漿中SOD、CAT活性明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)；山楂葉總黃酮中、高劑量組大鼠肺組織勻漿中SOD、CAT活性明顯高于模型組(P均<0.05)。見表2。

圖9　山楂葉總黃酮15 mg/kg組大鼠肺細(xì)胞

圖10　山楂葉總黃酮30 mg/kg組大鼠肺細(xì)胞

圖11　山楂葉總黃酮60 mg/kg組大鼠肺細(xì)胞

圖12　舒血寧4 mg/kg組大鼠肺細(xì)胞凋亡狀況(TUNEL，×400)

3討論

肺缺血再灌注損傷是臨床上開展肺移植、體外循環(huán)心臟等手術(shù)時(shí)常發(fā)生的肺損傷現(xiàn)象，是導(dǎo)致術(shù)后肺功能障礙的重要原因。隨著對其病理生理機(jī)制研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)恢復(fù)血流再灌注后，隨著氧的大量涌入而導(dǎo)致氧自由基的大量生成與過剩，進(jìn)而引發(fā)的肺組織廣泛氧化應(yīng)激損傷和肺細(xì)胞凋亡是肺缺血再灌注損傷重要的病理生理基礎(chǔ)。麻日虎等[6]和廖秀清等[7]通過動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)肺缺血再灌注損傷大鼠模型可改善抗氧化酶系統(tǒng)活性，抑制氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞凋亡，從而對肺缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)采用夾閉左肺門45 min后去夾的方法制備肺缺血再灌注損傷大鼠模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)山楂葉總黃酮30，60 mg/kg預(yù)處理后能夠有效降低肺缺血再灌注損傷大鼠W/D，其中60 mg/kg預(yù)處理還能有效提高p(O2)；山楂葉總黃酮預(yù)處理能夠有效改善肺組織病理學(xué)改變并抑制肺組織細(xì)胞凋亡，以60 mg/kg預(yù)處理效果最為顯著；提示山楂葉總黃酮對大鼠肺缺血再灌注損傷具有劑量依賴性的保護(hù)作用。

表2　各組大鼠肺組織勻漿中SOD、CAT活性

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05; ②與模型組比較，P<0.05。

血清中脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量能夠間接反映機(jī)體氧化應(yīng)激損傷程度；MPO是中性粒細(xì)胞特有的酶，其活性也能夠間接反映氧化應(yīng)激損傷程度[8]。SOD能夠提供氫原子配體而催化還原氧自由基生成H2O2，并在CAT的作用下進(jìn)一步還原生成對人體無害的H2O和O2[9]；血清中T-AOC水平能夠反映機(jī)體整體抗氧化能力水平；因此SOD、CAT活性和T-AOC水平能夠反映機(jī)體抗氧化能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山楂葉總黃酮30，60 mg/kg預(yù)處理后肺組織勻漿中SOD、CAT活性顯著升高，血清MDA含量及MPO活性顯著降低，并且60 mg/kg預(yù)處理還能有效提高血清T-AOC水平；提示山楂葉總黃酮能夠劑量依賴性地改善肺缺血再灌注大鼠抗氧化酶活性，抑制氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，山楂葉總黃酮對大鼠肺缺血再灌注損傷具有劑量依賴性的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與山楂葉總黃酮能夠有效改善肺組織抗氧化酶活性、進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]吳曉光,郭園園,董榮芳. 山楂葉總黃酮預(yù)處理對腦缺血再灌注小鼠腦組織抗氧化酶的影響[J]. 承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,24(2):119-121

[2]楊宇杰,林靜,王春民,等. 山楂葉總黃酮對大鼠高脂血癥早期干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中草藥,2008，39(12):1687-1690

[3]李紅,張爽,紀(jì)影實(shí),等. 山楂葉總黃酮不同給藥途徑對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]. 中國老年學(xué)雜志,2012，3(32):995-997

[4]高東雁,劉健,李衛(wèi)平,等. 山楂葉總黃酮對大鼠心肌缺血性損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J]. 中藥藥理與臨床,2012，28(5):64-66

[5]Xia ZY,Gao J,Ancharaz AK. Protective effect of ischemic post conditioning on lung ischemia-reperfusion injury in rats and the role of heme oxygenase-1[J]. Chin J Traum,2009，12(3):162-166

[6]麻日虎,李瑩,王玉璇. 參附注射液后處理對肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]. 中國藥物與臨床,2013，13(4):437-439

[7]廖秀清,熊平,肖曉. 黃芪甲甙對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]. 廣東醫(yī)學(xué),2009，30(12):1778-1780

[8]段若望,李明新,宋炯. 不同血液pH值對大鼠肺移植時(shí)缺血再灌注損傷的影響[J]. 中華麻醉學(xué)雜志,2010，30(6):685-687

Study on the protection and mechanism of Hawthorn leaves flavonoids against lung ischemia-reperfusion injury in rats

LIU Xuefeng

(First Hospital of Xingtai, Xingtai 054001, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the protective effects and mechanism of Hawthorn leaves flavonoids (HLF) against lung ischemia-reperfusion injury in rats. Methods 120 male SD rats were randomly divided into sham operation group, model group, HLF 15 mg/kg group, HLF 30 mg/kg group, HLF 60 mg/kg group and Shuxuening group. Except the sham operation group, the other animals were prepared for lung ischemia-reperfusion injury model of rats by interrupting the hilum of left lung for 45 min and then reperfusion. The animals in all groups were given normal saline or corresponding drug by intraperitoneal injection before 30 min of operation. After reperfusion for 2h, the p(O2) was detected, the lung tissue wet/dry (W/D) ratio was calculated, the histopathological changes were observed by HE dyed and apoptosis of lung tissue were observed by TUNEL dyed; the content of MDA, the activity of MPO, the level of T-AOC in serum, and the activity of SOD, CAT in lung tissue were detected.Results The value of p(O2) and T-AOC level in HLF 60 mg/kg group were markedly higher than those in model group (all P<0.05), the content of MDA, the activity of MPO and the lung tissue W/D ratio in HLF 30 mg/kg group and HLF 60 mg/kg group were significantly lower than those in model group (all P<0.05). The histopathological changes and apoptosis of lung tissue in all HLF group were improved significantly than those in the model group (all P<0.05), and the HLF 60 mg/kg group was the best; the content of MDA and the activity of MPO in HLF 30 mg/kg group and HLF 60 mg/kg group were significantly higher than those in model group (all P<0.05). Conclusion HLF has dose-dependent protective effects against lung ischemia-reperfusion injury in rats, which perhaps relate to its effects of improving antioxidant ability and inhibiting the oxidative stress.

Key words:Hawthorn leaves flavonoids; lung tissue; ischemia-reperfusion; protective effect

[作者簡介]劉雪峰，男，本科，主要從事藥學(xué)管理及研究工作。

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.03.010

[中圖分類號]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)03-0257-05

[收稿日期]2015-08-26