異丙酚對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力的影響

馬浩文，夏中元，趙 博，劉 敏，侯家保

武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，湖北 武漢 430060

異丙酚對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力的影響

馬浩文，夏中元，趙 博，劉 敏，侯家保

武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，湖北 武漢 430060

目的 觀察異丙酚對(duì)人胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力的影響，并探討可能的作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)HGC-27細(xì)胞，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組用不同濃度(5、10、20 μg/mL)異丙酚處理HGC-27細(xì)胞24 h，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力；Western blotting 檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、Akt、p-Akt及 p-GSK-3β的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組比較，異丙酚可顯著降低HGC-27細(xì)胞侵襲能力；異丙酚處理后，MMP-9表達(dá)下調(diào)；異丙酚可抑制p-Akt及其下游蛋白p-GSK-3β的表達(dá)。結(jié)論 異丙酚可降低人胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力，其機(jī)制可能與抑制Akt通路、下調(diào)MMP-9表達(dá)有關(guān)。

異丙酚；HGC-27細(xì)胞；侵襲；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；Akt信號(hào)通路

腫瘤的主要治療方式是外科手術(shù)切除，外科手術(shù)通常在全身麻醉下進(jìn)行，但麻醉藥物可抑制機(jī)體免疫反應(yīng)，手術(shù)過程中也可能引起癌細(xì)胞向周圍組織或血液中擴(kuò)散，因此，手術(shù)過程中很容易發(fā)生腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散[1]。目前異丙酚是臨床最常用的靜脈麻醉藥物之一。研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，異丙酚對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞、黑色素瘤RMPI-7951細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人纖維素瘤HT1080細(xì)胞和人骨肉瘤細(xì)胞HOS細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的侵襲能力均有抑制作用。

研究[4-5]證實(shí)，Akt信號(hào)通路在細(xì)胞代謝、增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等過程中起重要調(diào)控作用，異常或過度激活的Akt通路可促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。異丙酚對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力的作用尚不清楚，本研究旨在探討異丙酚對(duì)胃癌HBC-27細(xì)胞侵襲能力的影響，探討其對(duì)Akt信號(hào)通路的影響，并分析其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料細(xì)胞株：胃癌HGC-27細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；主要試劑：異丙酚注射液(Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)，RPMI 1640培養(yǎng)液(碧云天生物技術(shù)研究所)；Transwell小室(Corning公司)；Matrigel膠(BD公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG(武漢博士德生物科技有限公司)；Akt、p-Akt(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)、MMP-9及 β-actin抗體(購自Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中后置于37 ℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2～3 d后觀察培養(yǎng)基顏色及培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)，若培養(yǎng)基顏色變淡而細(xì)胞未長(zhǎng)滿則將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，在無菌操作臺(tái)上操作，棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2～3遍，加入適量新培養(yǎng)基，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組、5 μg/ml異丙酚組、10 μg/ml異丙酚組和20 μg/ml異丙酚組，作用時(shí)間均為24 h。

1.2.2 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力：將Matrigel膠放置于4 ℃冰箱過夜，用4 ℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋融化后的Matrigel膠至終濃度為1 mg/ml；將100 μl稀釋后的Matrigel膠加入Transwell小室底部中間區(qū)域，讓膠體自由向四周擴(kuò)散，使其均勻鋪在小室底部，37 ℃溫育5 h使其干成膠狀；實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞培養(yǎng)試劑和Transwell小室放在37 ℃條件下預(yù)熱；將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞血清饑餓12 h，收集細(xì)胞，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，1 500 r/min(離心半徑3 cm)離心5 min后，用無血清培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml左右；將600 μl含10%血清的培養(yǎng)基加入24孔板底部，150 μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室內(nèi)，用鑷子將小室轉(zhuǎn)移至含10%血清的培養(yǎng)基的24孔板中，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；24 h后，用鑷子小心取出小室，吸干小室內(nèi)培養(yǎng)基，用經(jīng)PBS濕潤(rùn)的棉簽輕輕拭小室內(nèi)的細(xì)胞后將小室移到含800 μl甲醇的孔中，室溫下放置固定30 min；取出小室并吸干室內(nèi)固定液，移到含結(jié)晶紫染液的孔中，室溫下放置染色15 min；用清水浸泡并輕輕沖洗數(shù)次，然后取出小室，吸去上室液體，用鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干；顯微鏡下取5個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)Akt、p-Akt (Ser473)、p-GSK-3β (Ser9)及MMP-9蛋白表達(dá)：細(xì)胞接種及分組同上，收集細(xì)胞，用冷的PBS洗滌3遍，棄去PBS，加入三去污蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min，用雙蒸水泡過的細(xì)胞刮收集瓶中液體于EP管中，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，吸取上清，置于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，加入5×上樣緩沖液至提取的細(xì)胞蛋白樣品中，沸水煮沸5 min使蛋白變性。將膠板固定在電泳架上，加入電泳緩沖液，每孔加入40 μg蛋白樣品，同時(shí)在兩側(cè)的上樣孔中加入5 μl蛋白Marker作為分子量參照。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，根據(jù)條帶蛋白分布不同加入1∶1 000稀釋的兔抗人Akt、p-Akt(Ser473)及p-GSK-3β (Ser9)抗體，放入4 ℃冰箱內(nèi)搖床上孵育過夜，其中β-actin為內(nèi)參，次日TBST洗膜后，根據(jù)一抗來源不同分別加入1∶1 000稀釋的辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫放置2 h，再次TBST洗膜，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在室溫下孵育PVDF膜后放入暗盒中，暗室紅燈下曝光1 min，然后顯影、定影，對(duì)膠片進(jìn)行拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 異丙酚對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力的影響5、10、20 μg/ml濃度異丙酚處理HGC-27細(xì)胞24 h后，隨著藥物濃度的增加，穿過Trasnwell小室基底膜的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明異丙酚可降低胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力(見圖1、圖2)。

2.2 異丙酚對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響0、5、10、20 μg/ml濃度異丙酚處理HGC-27細(xì)胞24 h后，Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示隨著藥物濃度的升高，MMP-9表達(dá)逐漸降低(見圖3)，表明異丙酚可下調(diào)胃癌HGC-27細(xì)胞MMP-9表達(dá)。

圖1 異丙酚對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力的影響A:對(duì)照組(0 μg/ml異丙酚)；B:5μg/ml異丙酚組；C:10μg/ml異丙酚組;D: 20μg/ml異丙酚組

注：與對(duì)照組(0 μg/ml異丙酚)比較，#P<0.05。

2.3 異丙酚對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞Akt信號(hào)通路的影響HGC-27細(xì)胞經(jīng)不同濃度異丙酚(0、5、10、20 μg/ml)處理24 h后，細(xì)胞總Akt表達(dá)量沒有變化，而p-Akt表達(dá)減少，同時(shí)，Akt下游效應(yīng)蛋白p-GSK-3β表達(dá)也減少，且呈濃度依賴性(見圖4)。表明異丙酚能抑制HGC-27細(xì)胞Akt磷酸化，并抑制下游蛋白的活性，即抑制HGC-27細(xì)胞Akt信號(hào)通路。

圖3 不同濃度異丙酚對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響

圖4 不同濃度異丙酚對(duì)HGC-27細(xì)胞Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致臨床治療失敗和患者死亡的主要原因。異丙酚對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲作用尚未見報(bào)道，本研究以人胃癌HGC-27細(xì)胞為對(duì)象，觀察異丙酚對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力的影響，探討其對(duì)MMP-9和Akt信號(hào)通路的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)異丙酚處理后，HGC-27細(xì)胞侵襲能力隨著藥物濃度的增加逐漸降低，MMP-9表達(dá)量也逐漸降低。

細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的降解破壞在腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離穿過組織屏障，導(dǎo)致細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類鋅離子依賴的細(xì)胞外蛋白水解酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)、破壞基底膜，促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。MMP-9是MMPs中明膠酶的一種，在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原，參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[6-7]。本實(shí)驗(yàn)采用Tanswell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，其原理是將Matrigel膠鋪在人工膜表面，模擬體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)，腫瘤細(xì)胞必須借助自身分泌的一些蛋白酶破壞細(xì)胞外基質(zhì)后才可通過人工膜，繼而反映腫瘤細(xì)胞的侵襲力強(qiáng)弱。結(jié)果提示異丙酚可通過下調(diào)MMP-9表達(dá)降低HGC-27細(xì)胞侵襲能力。

Akt信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等過程中的關(guān)鍵組成部分，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要調(diào)控作用。Akt及p-Akt在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，p-Akt是Akt的活化形式，Akt磷酸化激活后，可對(duì)下游相關(guān)蛋白包括BAD、GSK-3β、NF-κB等進(jìn)行調(diào)節(jié)，最終促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，Akt激活后可通過激活MMP-9及MMP-2，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HGC-27細(xì)胞經(jīng)異丙酚作用后，Akt總的表達(dá)量沒有變化，而p-Akt及Akt下游效應(yīng)蛋白p-GSK-3β表達(dá)均減少，且呈濃度依賴性，表明異丙酚可抑制HGC-27細(xì)胞Akt信號(hào)通路。本研究結(jié)果提示異丙酚可能通過抑制Akt信號(hào)通路、下調(diào)MMP-9表達(dá)，進(jìn)而降低HGC-27細(xì)胞侵襲能力。

綜上所述，本研究結(jié)果提示異丙酚在體外能降低胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力，其作用機(jī)制可能是通過抑制Akt信號(hào)通路進(jìn)而下調(diào)MMP-9表達(dá)，其對(duì)其他腫瘤細(xì)胞作用及其抗腫瘤機(jī)制尚需進(jìn)一步探索和研究。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Effect of Propofol on the invasiveness of HGC-27 gastric cancer cells

MA Haowen, XIA Zhongyuan, ZHAO Bo, LIU Min, HOU Jiabao

Department of Anesthesiology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China

Objective To investigate the effect of Propofol on the invasiveness of HGC-27 gastric cancer cells and explore the possible mechanisms. Methods HGC-27 cells were cultured in vitro, and then they were divided into two groups:control group and Propofol treatment group. The control group

only the culture medium. After treatment by Propofol at different concentrations (5, 10 and 20 μg/ml) respectively for 24 h, the invasiveness of HGC-27 cells was tested by transwell assay. Western blotting was used to detect MMP-9, Akt, p-Akt and p-GSK-3β. Results Compared with control group, the invasiveness of HGC-27 cells was significantly decreased in Propofol treatment group. Western blotting showed that Propofol decreased the expressions of MMP-9, p-AKT and downstream effector of p-GSK-3β in a dose-dependent manner. Conclusion Propofol inhibits the cell invasiveness of HGC-27 cells, and the effects of antitumor may be associated with inhibition of the Akt signaling pathway, thus down-regulating the expression of MMP-9.

Propofol; HGC-27 cells; Invasiveness; MMP-9; Akt signaling pathway

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.06.007

馬浩文，碩士，研究方向：臨床麻醉及危重醫(yī)學(xué)。E-mail: mahaowenmzk@163.com

夏中元，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：臨床麻醉及危重醫(yī)學(xué)。E-mail: xiazhongyuanmzk@163.com

R735.2

A

1006-5709(2016)06-0623-03

2015-08-31